viernes, 26 de octubre de 2012
2.3.7.3. TRASPLANTE Y ADAPTACIÓN BAJO CONDICIONES DE INVERNADERO.
Las plántulas entre 4 y 5 cm
obtenidas in vitro una vez que desarrollaron sus raíces y se han alongado,
se traslada a un invernadero, procurando
realizar esta actividad por la mañana para
no dañarlas por el calor. Ya dentro del invernadero, la preaclimatización consistió en que
los frascos se destaparan, dejándose bajo malla sombra durante 48 horas, con la
finalidad de que las plantas comenzaran a adaptarse acondiciones diferentes a
las existentes en el laboratorio donde estaban a temperatura promedio de 26 ± 2
ºc y fotoperiodo de 10 horas luz (lámparas de luz blanca fría fluorescente, con
intensidad lumínica de 2000 lux) y 14 horas de oscuridad. Antes de transplantar,
se elimina completamente el medio de cultivo de las raíces, para ello se colocaran
las plántulas en un recipiente con agua limpia y el medio se eliminara de las
raíces manualmente sin dañar a las plántulas.
Con la finalidad de evitar contaminación por enfermedades fungosas, las plántulas se sumer durante cinco minutos en un recipiente que contenga una solución preparada
con fungicida. Para el trasplante se utiliza un sustrato el cual se esteriliza.
2.3.7.2. DESINFECCION O ESTERILIZACION DEL SUSTRATO
En todo momento deberá realizarse un riguroso control fitosanitario empleándose
antibióticos, fungicidas e insecticidas de uso
universal
2.3.7.1. TIPOS DE SUSTRATOS
Otro aspecto importante a
tener en cuenta lo constituye la elección del substrato, siendo el adecuado
aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las raíces. Se puede
emplear: arena, perlita, turba,
vermiculita, o mezclas de ellos,
teniendo la precaución de realizar una esterilización previa. Es
conveniente el agregado de
fertilizantes, sea a través del substrato
(fertilizantes de liberación controlada)
o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes solubles); empleándose proporciones ricas en fósforo (N-P-K:
9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-25-35) que favorecerán el desarrollo radicular y la rustificación de
las plantas.
2.3.7. TRASPLANTE AL SUSTRATO
En el momento en que se extraen los explantes enraizados de los frascos,
están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han
enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y
generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la
transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente
funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado
lentos para evitar la desecación del explante. Crecer en ambientes tan húmedos
también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que
representa la barrera física para evitar la pérdida de agua a lo largo de toda
la superficie de la planta. Las plántulas recién enraizadas son sensibles a los
cambios ambientales y esto va a depender del éxito o el fracaso. Mediante
aclimatizacion (endurecimiento) entre 4-8 semanas
Paulatina y secuencialmente
1. Se controla la luz desde el
20% hasta el 100%
2. Sustrato en las 2 p´rimeras
semanas riega ms 25%
3. Hr se mantiene desde 100
normal
4. Se mantiene con nebulización
5. Normal se cortan las raíces
de las plantas in vitro .
2.3.6.4. PREADAPTACION Y TRASPLANTE
Este período de adaptación al
nuevo hábitat es llamado fase o etapa de
aclimatación. La estrategia a implementarse durante el mencionado ciclo deberá
contemplar el control minucioso de los parámetros ambientales (humedad,
temperatura y luz) de tal manera que permita disminuir la deshidratación y, al
mismo tiempo, estimular la fotosíntesis con el objeto de generar un rápido
crecimiento de los plantines. El retraso
en el desarrollo de la cutícula y la escasa funcionalidad del aparato
estomático que presentan las hojas de la mayoría de las especies
cultivadas in vitro, determinan una alta
tasa de transpiración que puede ocasionar la muerte por deshidratación. El control de
este proceso fisiológico es de vital importancia durante la aclimatación,
teniendo en cuenta que la disminución de la transpiración será gradual y dependerá
de la rehabilitación de los estomas, así como también del desarrollo de la
cutícula.
El equipamiento necesario
estará sujeto a la especie, pudiendo utilizarse desde túneles de polietileno
para plantas que posean un elevado control de la transpiración (por ej. Malus
pumila o Agave tequilana) o bien, a través del empleo de cámaras climatizadas
(Fig.1) equipadas con sensores que permiten un descenso paulatino de la humedad
relativa. En algunos casos puede
resultar necesaria la aplicación exógena de ABA (hormona involucrada en el
control del cierre de los estomas) o bien, el empleo de sustancias
antitranspirantes que forman una capa semipermeable en la superficie de la
hoja. En este último caso deberán tomarse algunas precauciones debido a que
pueden observarse reacciones de fitotoxicidad.
Resulta imprescindible evitar
la exposición a temperaturas extremas tanto en la fase aérea como en el substrato. Mediante el
empleo de extractores y/o acondicionadores
de aire combinados con un sistema de niebla, es posible establecer la
temperatura de la fase gaseosa entre los
25 y 30 ºC durante la estación estival, mientras que en la época invernal es
necesario, a veces, el empleo de mantas térmicas o serpentinas, sea de agua o
aire caliente a nivel del substrato, para mantener la temperatura por encima de
los 18-20 ºC.
Sin lugar a dudas, la opción
más económica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia
(20-50%) mediante el agregado de mallas de sombreado («saram»). No obstante, en
aquellas latitudes donde el nivel medio
de luz natural es bajo y los días
son cortos durante una parte considerable del año, la luz artificial puede ser
aplicada como complemento de la luz natural. Las lámparas tubulares
fluorescentes del tipo «luz día» son
empleadas en horticultura para prolongar el fotoperíodo. Asimismo, las lámparas
tubulares de sodio alta presión presentan
una distribución espectral de la energía adecuada para estimular
fotosíntesis y se emplean para tal fin en una amplia variedad de cultivos.
2.3.6.3. ENRAIZAMIENTO
Cambios anatómicos durante formación de
raíces
Ø Dediferenciación:
l Formación de nuevos sitios
meristemáticos
l Marcado por división anticlinal
Ø Divisiones celulares iniciales:
l Grupos de células sin polaridad,
simétricas, no determinadas
Ø Divisiones laterales para formar
meristema radical determinado:
l 1500 células, simetría bilateral
Ø Crecimiento y emergencia (división
y alargamiento):
l Unión vascular con tallo
l Raíz es visible
Cambios
fisiológicos durante formación de raíces
Ø Iniciación día 0 a día 3:
l Divisiones anticlinales en
periciclo
l Depende de AIA del ápice de raíz
primaria
Ø Emergencia: día 3 a día 10:
l Salida de raíces
l Requiere de fuente diferente de
auxina (ápice y hojas jóvenes)
l Duplica la concentración en
forma de pulso (alta conc/corto tiempo)
l No ocurre si se decapita planta,
si al adicionar auxina
Ø Independencia:
l Crecimiento de raíz
l Independiente de auxina de ápice
y de raíz primaria
Causas
para variabilidad de enraizamiento
Ø Condiciones ambientales y de
nutrición de la planta y de los esquejes
Ø Manejo de los explantes luego de
su separación de la planta madre
Ø Concentración, método de
aplicación y tipo de sustancia reguladora
Ø Interacción entre sustancias RC
Ø Edad de los esquejes
2.3.6.2. CRECIMIENTO DE YEMAS ADVENTICIAS
Se pueden iniciar nuevos
ápices de ramas o brotes ya sea:
1.
Directamente del explante
2.
indirectamente del callo que se forma en la
superficie cortada del explante.
Los dos factores más
importantes que afectan la iniciación de brotes adventicios son:
1.
la relación del explante
2.
El régimen de hormonas que se suministran a las
plantas.
Entre los tipos de explantes
hay porciones de hojas que se usan en plantas como Saintpaulia y rábanos
picantes que de manera natural se regeneran de esta forma. Se utilizan
explantes de puntas de tallos en varias especies como en orquídeas, y helechos
en los cuales se desarrollan masas de tejidos de tipo callo y regeneran a un
gran numero de brotes, con el tiempo las plantas iniciadas de puntas de callos
con el propósito inicial de brotes axilares, pueden revertir a formar alto
porcentaje de brotes adventicios.
La iniciación directa
principia con células de parenquima que están situadas ya sea en la epidermis o
justo abajo de la superficie del tallo; algunas de esas células se vuelve
meristemoides las cuales aparentemente se originan de células individuales, sin
embargo, la respuesta de los explantes depende de la concentración de hormonas El
desarrollo indirecto de brotes adventicios implica, primero la iniciación de callo basal de los brotes separados en
cultivos, Los brotes se originan en la periferia del callo e inicialmente no
están conectados al tejido vascular del explante, de manera similar, en plantas
intactas, si se aplica citoquinina en bloques de agar cilíndrico pueden
originarse de brotes del callo formado en el ápice de epicotilos decapitados.
En general la formación de brotes adventicios puede conducir a tasas muy
elevadas de multiplicación, mas altas que los que se obtienen de ramas
axilares. Por otra parte, los brotes adventicios pueden aumentar las tasas de
producción de plantas aberrantes, resultantes de la partición de quimeras que
en algunos cultivares resulta en la perdida de la variegacion y en reversiones
a una condición más juvenil, cuando se use este sistema las plantas producidas
deben evaluarse cuidadosamente respecto a la posible variación. Las diferentes plantas pueden responder en un modo distinto
a las diversas citoquininas y auxinas a parte debido a su control hormonal
natural. Una secuencia apropiada de hormonas es de importancia particular en
cuanto que una hormona puede tener un
efecto inductor pero debe estar ausente o en cantidad reducida para que crezca
el órgano.
2.3.6.1. FORMACION DE CALLO
Callo: masa de células
desdiferenciadas obtenidas a partir de un explanto cultivado in vitro (disco de
hoja, meristema, células en suspensión, etc.). Es posible regenerar brotes o
vástagos a partir de estos callos.
La composición salina más
empleada para inducir la formación de callo, la organogénesis directa o
indirecta en la mayoría de las especies vegetales, es la de Murashige &
Skoog (1962) (MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseñadas para
inducir determinados patrones morfogénicos. Existe, además, una estrecha
relación entre la composición hormonal del explante y la concentración de
reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo.
2.3.6. CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE
Algunos de los cambios fisiológicos que presentan los explantes son los
siguientes:
1.
Estomas atrofiados, no son funcionales al 100%.
2.
Cutícula más delgada y con aberturas.
3.
Parénquima desorganizado, no están unidas, es
decir, es ineficiente.
4.
Con menos luz y azúcar en las plantas se realiza
menos fotosíntesis y en gran porcentaje son heterótrofas y en poco porcentaje
son autótrofas.
5. Como
tienen mucha humedad relativa las raíces son más delgadas, pocas raíces y no
son funcionales.
Apuntes
de la clase de Biotecnología Vegetal
2.3.5.4. HUMEDAD RELATIVA
La humedad relativa (HR) como
medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la atmósfera gaseosa, es
otro de los parámetros físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del sello o
cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermético, la humedad interior
será del 100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad
interna puede descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso
del contenido de HR puede promover una pérdida veloz de agua del medio de
cultivo, variando la concentración de sus compuestos hasta llegar a niveles
tóxicos.
2.3.5.3. TEMPERATURA
La temperatura de incubación
de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien en las
condiciones naturales de cultivo las plantas tienen diferencias térmicas
durante el día y la noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi
estables. Es importante señalar que cuanto más se asemejen las condiciones in
vitro a las óptimas de crecimiento de la especie estudiada, mayor será la
respuesta esperada. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos
a diferentes temperaturas, se observó que la regeneración mayor de brotes se
obtuvo a 12 ºC, mientras que por encima de los 30 ºC casi no hubo
diferenciación.
2.3.5.2. INTENSIDAD LUMINICA
La luz es uno de los factores
principales que determinan el desarrollo de los
organismos autótrofos, en ello
radica la importancia de controlar el factor luz en los
cultivos in vitro. Los
aspectos aspectos relacionados con la luz que son importantes en los cultivos
in vitro son:
- · La cantidad de luz: LA IRRADIACIÓN . La irradiancia puede ser expresada en función de la energía por unidad de superficie W/m2
- · La calidad de la luz: EL ESPECTRO (λ) Los tubos fluorescentes son las fuente de luz más usada en las cámaras de cultivo.
La luz suministrada a los
cultivos debe ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad y período de
suministro. La respuesta morfogénica de un explante puede variar según se le
proporcione luz o no. Para estimular la formación de callo es común que se
prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciación de
órganos. Los procesos morfogénicos dependen del genotipo seleccionado, pero,
además, debe sumarse el efecto del explante seleccionado. El tratamiento de la
planta madre, las condiciones físicas y fisiológicas en las que ésta se
encuentre y el sector del cual se tome el explante determinarán a su vez la
respuesta morfogénica en condiciones in vitro.
2.3.5.1. FOTOPERIODO
La alternancia de los ciclos
de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del
desarrollo de las plantas (germinación, La alternancia de los ciclos de luz con
los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de
las plantas (germinación, floración, tuberización,...) pueden ser activados por
el número de horas diarias de luz que recibe la planta. De forma análoga, el
número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar
a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor
fotoperiodo in vitro. En general se utiliza luz blanca y un fotoperiodo de 16hs
de luz y 8 hs de oscuridad.
2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACION
Factores
relacionados con el ambiente de incubación
- · Luz, obscuridad o fotoperiodo
- · Tipo de luz
- · Temperatura
Como se puede ver el numero de factores implicados en el proceso de organogénesis es muy grande, y el fenómeno en si no se comprende lo suficiente como para manipularlo a partir de una base solida de conocimientos. Los conocimientos básicos que se tienen hasta la fecha provienen en su inmensa mayoría de experimentos de ensayo y error. Debido a esto al trabajar por primera vez con una especie deberán montarse experimentos que nos permitan desarrollar el mejor sistema para regenerar órganos a partir de ese material vegetal.
La incubación de los cultivos
se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se
refiere a temperatura, calidad e
intensidad de luz, fotoperíodo, humedad atmosférica e higiene. Estas
condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos
especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor) y una buena y
uniforme circulación de aire en el interior y dotados de un buen sistema de
alarma para cortar la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado.
En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con
ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es
generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con
una irradiancia de entre 50 y 200μmol m-2s-1. La humedad atmosférica debe ser
elevada (80- 90%).
2.3.4.3. SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS: SOLIDOS Y LIQUIDOS
Consistencia del medio.
El metabolismo de los tejidos
puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo
(líquido o semi-sólido). dependiendo de las características del medio de
cultivo (líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la
concentración y calidad del ágar pueden tener importantes efectos en el
desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo
en medio líquido se utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a
través de las siguientes vías. El cultivo en medio líquido se
utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las
siguientes vías:
- - Inducción de embriogénesis
- - Cultivo de protoplastos
- - Cultivo de suspensiones celulares
Otro aspecto importante a tener
en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como
semisólido o líquido. El agente gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído de diversas
algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la
expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o
promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia
chinensis, cultivadas en una solución de MS con el agregado de 0,1 mg.L -1 de AIA + 1 mg.L -1 de BAP, donde se observó una respuesta
morfogénica diversa según el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el
gelificante empleado fue Chubut-agar, de producción nacional, se observó una
gran diferenciación de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar
SIGMA R
sólo se indujo la proliferación de callo. En caso de seleccionar medios de
cultivo líquidos, la respuesta morfogénica observada varía de manera
considerable. El cultivo líquido es imprescindible cuando se busca promover la
morfogénesis indirecta a través de suspensiones celulares. Para ello es
necesario cultivar los callos en medio líquido con agitación para permitir que
las células se disgreguen y puedan diferenciar raíces, brotes o embriones
somáticos en forma aislada. La selección del medio de cultivo
líquido o sólido depende, además, de la especie empleada. En Cymbidium spp, por
ejemplo, se ha observado que el empleo de medio de cultivo líquido promueve una
mayor diferenciación de protocormos respecto del mismo medio gelificado. A su
vez, este proceso puede mantenerse durante varios subcultivos mientras que en
medio de cultivo gelificado se observó que los protocormos tienden a formar tallos.
2.3.4.2. DISECCION DEL EXPLANTE
Cultivar los explantes en una
cámara de transferencia con aire estéril («gabinete de flujo laminar»), localizada en un ambiente
limpio y no expuesta a corrientes de
aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la
luz UV en forma directa). La mesada de
trabajo y las paredes del gabinete deben
ser desinfectadas previamente con etanol
al 70%. De la misma manera deben ser
desinfectados exteriormente todos los
recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área del aire estéril. Los operarios
constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación,
porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se
des infecten con etanol al 70 %. La
utilización de guardapolvos, guantes y máscaras protectoras de la boca y
de la nariz, así como los gorros protectores
de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo
(pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso.
Muchos de estos instrumentos pueden ser
colocados en etanol al 95% y, antes de
ser usados, se deben flamear
cuidadosamente en la llama de un
mechero. También es necesario flamear la
boca de los recipientes que contienen
los medios de cultivo antes y después
de cultivar el explante. Incubar los cultivos en cámaras o cuartos de cultivo, cerrados, libres de corrientes de
aire y bien higienizados. En lo posible se debe restringir la circulación de
personas, y los recipientes con cultivos
contaminados deben ser rápidamente
eliminados de este sector. Es conveniente
que antes del lavado, estos cultivos
sean esterilizados.
2.3.4.1. DESINFECCION DEL EXPLANTE
Realizar una adecuada
preparación de la planta dadora de
explantes, cultivándola preferentemente
en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos.
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser
establecidos en condiciones de cultivo. Protocolo del tipo de esterilización
superficial de material vegetal son:
- - Lavado con agua corriente durante 20-30min
- - Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
- - Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2 ), entre el 0,01 y 0,05%.
- - Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).
- - En el caso del HgCl2 , el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.
2.3.3.3. TAMAÑO DEL EXPLANTE
El tamaño del explante es un
factor que tambien puede determinar la respuesta in vitro. Explantes muy
pequeños requieren el empleo de medios de cultivo mucho mas complejos y la
vitalidad y la capacidad regenerativa tiende a ser bajas. Explantes grandes son
mas difíciles de desinfectar pero generalmente poseen un mayor potencial
regenerador considerablement mayor. En
varios trabajos se han demostrado las ventajas que ocasiona el pretratamiento
de las plantas donantes con reguladores del crecimiento para reactivar el
desarrollo de las plantas donantes.
2.3.4. SIEMBRA DEL EXPLANTE
Una
vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado
para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y
levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y
desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo
y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996). Los
explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire
filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un
medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las
necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el
rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de
humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo. Una
vez que los explantes luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han
desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al
invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los
explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy
diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el
estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte &
Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in
vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece
–ya en condiciones normales– y al cabo de una semanas está lista para ser
trasladada al campo de cultivo.
2.3.3.2. POSICION DEL EXPLANTE EN LA PLANTA
El mejor explante que podemos utilizar en la planta es aquel que se encuentra en posición del tercio de en medio de la planta, es decir la planta la dividimos en tres partes, escogemos los explantes de la parte de en medio todos los que esten ubicados en esa zona, estos son potencialmente buenos para usarlos de explante en cultivos in vitro.
INFORMACIÓN OBTENIDA DE LOS APUNTES DE LA CLASE DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL
2.3.3.1. TIPOS DE EXPLANTE
El material vegetal con el que
se inicia un cultivo in vitro puede ser cualquier célula, tejido u órgano de la
planta (explante). Comúnmente se
seleccionan aquellas partes de la planta que se encuentran en división activa,
como las regiones meristemática:
·
Tejidos somáticos:
de tallo, raíz, hoja, meristemos
·
Tejidos
reproductores: anteras, polen, microesporas, óvulos, semillas
Si se elimina la pared celular
de las celulas se obtiene un cultivo de protoplastos.
2.3.3. EXPLANTE
El concepto de explante se
refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede
ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano
(semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.),
estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como
en el caso de los protoplastos). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes
están constituidos por tejidos y/o células somáticos. El nombre “explante” es
una versión castellanizada del vocablo inglés “explant”; acuñado especialmente
para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y sin otro
significado. La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en
el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del
tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su
contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera o de
otra.
La variación también puede ser
una consecuencia de quimerismo en el explanto original. Las quimeras son
mosaicos genéticos. Esto significa que dentro de una misma planta existen
células con diferente constitución genética, lo cual se debe a una serie de
cambios producidos durante el desarrollo en el ADN nuclear de ciertos tipos
celulares. Si estos tejidos se utilizan como explantos y sus células son
inducidas a dividirse y rediferenciarse, las diferentes líneas celulares
podrían entonces dar origen a plantas genéticamente diferentes. Por lo tanto,
la utilización de explantos con tejidos quiméricos preexistentes puede resultar
en una fuente extra de variación. Sin embargo, la recuperación de quimeras a
partir de explantos no quiméricos es un fenómeno frecuente que puede ocurrir a
partir de procesos organogénicos. La utilización de explantos con tejidos
organizados como esquejes radicales o caulinares sería una buena opción si es
necesario mantener estabilidad genética durante el cultivo in vitro. Sin
embargo, diferentes genotipos reaccionan de manera distinta, aún con explantos
«seguros». Parecería que el cultivo de meristemas aislados sería la mejor
opción para minimizar el riesgo de
variación somaclonal. Sin embargo, esto no debería tomarse como regla.
Utilizando técnicas moleculares fue posible detectar la ocurrencia de variación
en plantas de frutilla y paraíso obtenidas a partir de meristemas. El cultivo
de protoplastos parecería inducir, en ocasiones, inestabilidad genética, como
fue observado en papa y Nicotiana. Esto,
en ocasiones, ha sido asociado a los mayores tiempos en cultivo involucrados en
la regeneración de plantas a partir de explantos tan pequeños.
miércoles, 24 de octubre de 2012
2.3.2.5. EDAD DEL ORGANO O TEJIDO VEGETAL
Gran parte del cultivo de
tejidos, esta en la edad del explante que va ser utilizado para los trabajos.
La edad de la planta y el grado de diferenciación del tejido muchas veces etas
interrelacionados y pueden producir efectos interactivos se cultivan in vitro.
Por ejemplo, según los experimentos realizados por Toivonenn y Kartha en 1988,
quienes trabajaron con Pinus glauca,
descubrieron que las plántulas a las que se les extirpo los cotiledones 7 a 8 días
luego de ser plantadas, formaban las primeras yemas adventicias antes que
plántulas cuyas yemas fueron extirpadas luego de los 8 dias. Asi también de
yemas adventicias en explantes de hojas de Cucumis
melo, mostraron mayor producción en los explantes que tenían un tamaño
entre 0.3 y 0.5 mm los cuales tenían 14 días de plantados. Esta propiedad no
tenia aquellos explantes que tenían más de 21 días. La edad del explante puede
clasificarse en cuatro clases:
1.
Edad del
órgano o de la planta que ha sido extraida: es al edad biológica de la
planta, es el tiempo que transcurrió desde que la planta comenzó como retoño o
como embrión.
2.
Edad fisiológica
o ontogenetica o fase de crecimiento: incluye los conceptos de juvenilidad
y adulto.
3.
El grado
de diferenciación: con este concepto, las partes más jóvenes de la planta
son células meristematicas no diferenciadas. Teóricamente se dice que algunas
plantas poseen las células meristematicas siempre en estado juvenil y que podrían
vivir para siempre.
4.
Periodo de
cultivo: es el tiempo desde que recién se instala el cultivo.
2.3.2.4. CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LA PLANTA
Los cultivos de tejidos
vegetales deben mantenerse en condiciones ambientales semejantes a las
naturales más favorables. La luz, la temperatura y la humedad relativa son los
principales factores del ambiente que inciden sobre los cultivos. El comportamiento
de muchos cultivos depende de la calidad, intensidad y fotoperíodo de la luz
que reciben, dado que varias enzimas involucradas en el desarrollo y en el
metabolismo secundario son influenciadas por la luz. La mayoría de los cultivos
desarrollan a una intensidad luminosa entre 5 a 25 W/m 2 (1000 a 5000 lux). Si
bien la calidad de la luz puede determinar diferentes respuestas morfogénicas,
en general se utiliza luz blanca, pobre en longitudes de onda larga.
El fotoperíodo habitualmente
utilizado es de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, aunque algunos cultivos
requieren oscuridad. La temperatura de
las cámaras de cultivo se regula en general entre 22 y 28°C, permitiendo así el
desarrollo tanto de especies de climas templados como de plantas tropicales. Es
de destacar que durante el período iluminado, la temperatura en el interior de
los frascos de cultivo es 1-2°C superior a la de la cámara, debido al efecto
invernadero; se crea así un termoperíodo
suave. La velocidad de síntesis y de
degradación de distintos compuestos y por ende el nivel de producción y
acumulación de metabolitos también es influenciado por la temperatura. En
cuanto a la humedad relativa, ésta se mantiene en alrededor del 70 % en las
condiciones en las que se realizan habitualmente los cultivos, aunque varía con
la temperatura de la cámara y el tipo y cierre de los recipientes. El
porcentaje de humedad relativa no es reportado en la mayoría de los trabajos
sobre cultivo in vitro de vegetales.
2.3.2.3. EDAD DE LA PLANTA
La edad es un factor
importante ya que los tejidos juveniles
poseen un alto grado de actividad meristematica y tienden a tener mas
plasticidad in vitro que los adultos, como es el caso de la respuesta de
cotiledones, hipocótilos y hojas aisladas de material juvenil que son usadas
para micropropagacion. Los tejidos juveniles presentan una mayor capacidad
morfogenetica, la cual se manifiesta en respuesta de crecimiento, proliferación
y enraizamiento, a diferencia de un tejido maduro el cual es mas difícil de
desdiferenciar e inducir a la producción de raíces y brotes.
Es mucho más difícil propagar
material adulto que juvenil ya que los primeros son recalcitrantes, es decir,
difíciles de regenerar. Sin embargo, aún en estos casos es posible extraer
explantos de mayor capacidad regenerativa mediante dos formas:
1) seleccionando los tejidos
más juveniles dentro de un árbol.
2) induciendo el
rejuvenecimiento del árbol donante antes de aislar los explantos
Para seleccionar el material
más juvenil en una planta adulta hay que considerar el fenómeno de topófisis.
Este es un proceso por el cual el tipo de crecimiento de un nuevo individuo
está determinado por la posición que ocupaba en la planta adulta. Esto es
ocasionado por efecto del envejecimiento fisiológico e implica que los
explantos más reactivos in vitro se encuentran en las yemas de las áreas
basales del tronco y raíces.
2.3.2.2. FITOSANIDAD
La
propagación natural se producen en poca cantidad y son fuertemente dañadas por
parásitos y depredadores, razón por la cual es un factor limitante para la
obtención de material para futuras plantaciones. Las técnicas biotecnológicas
pueden jugar un rol importante, para el suministro adecuado de vitroplantas
como material de plantación. La germinación in vitro posibilita dicho proceso
en condiciones asépticas y controladas en cualquier época del año, permitiendo
disminuir el proceso de germinación así como obtener plántulas en condiciones
fitosanitarias apropiadas para trabajos de cultivo in vitro. Sin embargo, para
el establecimiento exitoso de estas especies, se hace necesario prevenir y
controlar la contaminación microbiana y oxidación fenólica, ya que constituye
uno de los problemas más graves en la micropropagacion.
El cultivo in vitro de tejidos
vegetales resulta una herramienta potente, básica y necesaria, en la
propagación de plantas que presentan dificultad para multiplicarse
vegetativamente, abarcando una serie de técnicas para su manipulación y control.
Básicamente consiste en el cultivo sobre un medio nutritivo artificial en
condiciones asépticas. Así, las plantas completas o partes de ellas
(explantes), como: semillas, embriones, órganos, tejidos, células y
protoplastos, pertenecientes a diversas especies vegetales, son cultivadas in
vitro. Dichas técnicas permiten controlar los procesos fisiológicos de
crecimiento y desarrollo de la planta, como son: división celular, germinación,
brotación, enraizamiento, floración y fructificación (8), además de que pueden
desempeñar un papel importante en el suministro adecuado de vitroplantas como
material de plantación.
La contaminación microbiana es
uno de los problemas más graves en la micropropagación de especies vegetales a
nivel mundial, produce cuantiosas pérdidas de material, tanto en los trabajos
de investigación como en la micropropagación comercial. Puede tener dos
orígenes: a) microorganismos que colonizan la superficie o el interior del
explante (endófitos) y b) microorganismos introducidos durante la manipulación
en el laboratorio. Los contaminantes más frecuentes en condiciones in vitro son
los hongos, las bacterias y levaduras, denominados "vitropatógenos",
aunque también existen otros menos frecuentes como los virus, viroides y microartrópodos
(ácaros y trips). El término
vitropatógeno ha sido usado para aquellos organismos que no son necesariamente
patógenos para las plantas en el campo, pero sí son perjudiciales para células,
tejidos u órganos cultivados in vitro, mientras que el término patógeno ha sido
confinado para describir a un organismo que causa enfermedad a las plantas
cultivadas en el campo. Se
ha sugerido que los vitropatógenos pueden ser dañinos para el cultivo de
tejidos vegetales, ya que compiten con el explante por los nutrientes del medio
y les producen daños directos e indirectos por la colonización de sus tejidos o
liberación al medio de metabolitos tóxicos, aunque en la actualidad no se
encuentran muchos trabajos en la literatura científica que expliquen el
mecanismo de acción de los contaminantes, que los hacen perjudiciales para las
plantas in vitro.
Algunos encontraron que la
inoculación de plantas in vitro de Hemerocallis con la bacteria no patógena
Lactobacillus platarum, un contaminante frecuente del cultivo de tejidos,
causaba una disminución del coeficiente de multiplicación, seguido de un rápido
deterioro de los cultivos. Ellos refirieron, además, que esto coincidió con el
incremento del número de bacterias y la concentración de ácido láctico en el
medio de cultivo. Ellos demostraron que el efecto perjudicial de Lactobacillus
plantarum era un resultado directo de la producción de ácido láctico, más que
del efecto general de la disminución del pH. Los coeficientes de multiplicación
de plantas infectadas con contaminantes bacterianos latentes pueden mantenerse
inalterables, pero reiteradamente se ha referido que decrecen. No obstante, en
el cultivo de células y tejidos vegetales, el efecto de la presencia de
microorganismos no ha sido ampliamente examinado.
Las bacterias son los
contaminantes in vitro más comunes y ocasionan serios problemas, porque pueden
ser sistémicas así como difíciles de detectar y eliminar. Estos microorganismos
escapan a los efectos de los esterilizantes superficiales y pueden ser inter o
intracelulares. Entre los últimos, se encuentran los virus, viroides y muchos
géneros bacterianos como: Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium,
Lactobacillus, Erwinia, Enterobacter y Pseudomonas. Su distribución puede ser
localizada o sistémica por xilema o floema. Estos contaminantes no se
manifiestan en los primeros subcultivos, ya que la alta presión osmótica, el pH
y ciertas hormonas de los medios de cultivo pueden inhibir su crecimiento.
Debido a este efecto inhibitorio, muchos microorganismos requieren un período
de adaptación a las nuevas condiciones antes de manifestar su presencia; esto
ocurre por lo general en la fase de multiplicación.
Entre las principales fuentes de contaminación bacteriana se citan los explantes, el ambiente de los locales de trabajo, los operadores y las técnicas deficientes de esterilización. Además, los microorganismos pueden diseminarse por ácaros, trips y hormigas. El ambiente de los locales de trabajo es una fuente de contaminación, ya sea directa o indirectamente. Se plantea que a través de las corrientes de aire, las partículas del suelo cargadas de esporas y células de microorganismos son arrastradas y penetran por los acondicionadores de aire, son transportadas e introducidas por el hombre y permanecen en el ambiente por condiciones higiénicas inadecuadas. Del mismo modo, el tipo de cultivo (anual o perenne), la forma de propagación (sexual o asexual) y las condiciones climáticas influyen en la gravedad de las contaminaciones. Las condiciones climáticas en zonas tropicales favorecen el desarrollo y la multiplicación de los microorganismos, que tienen un efecto negativo sobre los explantes. El éxito de los sistemas de propagación de plantas por biotecnología depende en gran medida del control y la prevención de la contaminación microbiana. Existen varias estrategias para controlar y manejar la contaminación, que incluyen la prevención mediante la selección y el tratamiento de la planta madre, la desinfección superficial del explante y la identificación de los microorganismos contaminantes, el control de la contaminación a través del uso de sustancias antimicrobianas y el cultivo de meristemos.
2.3.2.1. GENOTIPO
En general se asume que la
frecuencia de cambios dependerá de variaciones preexistentes en el genotipo y
de las interacciones que surgen entre el genotipo y el proceso de cultivo. En
arroz, ciertas variedades estables muestran niveles de variación que oscilan
entre el 0 y el 1%, mientras que en otras, consideradas inestables, oscilan
entre el 10 y el 27%. En Kalanchoe, especie ornamental, la variación somaclonal
es genotipo dependiente y se la utiliza como una herramienta para la obtención
de variedades.
La influencia del genotipo es un factor importante para
lograr la regeneración de plantas haploides o dobles haploides (diploides) que
pueden ser de utilidad en programas de mejoramiento.
http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&ved=0CCMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fredalyc.uaemex.mx%2Fsrc%2Finicio%2FForazarDescargaArchivo.jsp%3FcvRev%3D610%26cvArt%3D61030207%26nombre%3DEfecto%2520del%2520genotipo%2C%2520ambiente%2520y%2520%25E1cido%2520h%25FAmico%2520en%2520el%2520cultivo%2520In%2520Vitro%2520de%2520anteras%2520de%2520trigo&ei=DxSMUPrLMOyr2AX0_IHoBA&usg=AFQjCNEqf5khlcqzBaVG_uTwnFAdoPr5Yw&sig2=-7em378zFCG626UPruSOwg
2.3.2. SELECCIÓN DE PLANTAS MADRE
La correcta elección y
preparación del explanto incide directamente sobre la calidad del mismo y su
respuesta frente a los dos principales problemas que afectan al establecimiento
del cultivo, que son la contaminación con microorganismos y la oxidación del
explanto. Los factores que influyen sobre la calidad del explanto son: el tipo de órgano que sirve como
explanto, la edad ontogénica y fisiológica del mismo, la estación en la cual se
colecta el material vegetal, el tamaño y el estado sanitario general de la
planta donante.
La planta donante debe
elegirse en base a una selección masal positiva para las características
agronómicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es preciso definir
el tipo de explanto a establecer en condiciones in vitro. En general, los
órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el
establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de
explantos que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver
el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el
establecimiento del cultivo in vitro. Se recomienda colectar explantos
primarios a campo durante la estación primaveral y estival, cuando existe una
brotación activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormición
ocasiona serios problemas de contaminación. A fin de lograr explantos de
óptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas donantes por un tiempo
mínimo en condiciones de invernáculo. De esta forma es posible incidir directamente
sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos mediante el control de
la intensidad lumínica, temperatura y reguladores de crecimiento. Para especies
ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener las plantas
donantes en condiciones de alta temperatura (25ºC) y baja humedad relativa
(75%) a fin de reducir la proliferación de patógenos
Los procesos morfogénicos de
floración, dormición y bulbificación son controlados por el fotoperíodo y la
temperatura. Controlando estos factores también es posible obtener plantas donantes
y explantos más homogéneos durante todo el año. Pueden aplicarse además
pretratamientos con reguladores de crecimiento a las plantas donantes, así como
también a los explantos mismos. En especies leñosas suele utilizarse como
pretratamiento la inmersión de los explantos primarios en soluciones con
citocininas a fin de inducir la brotación de yemas.
2.3.1.4. ADAPTACION
Los explantes recién
enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito
o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las
plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las
mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los
explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer
en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes
con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras
responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no
son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por
lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra
parte, crecer en ambientes tan húmedos también su le implicar la falta de una
cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para
evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. La
siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta
en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en
condiciones naturales
IN VITRO:
- No realiza fotosíntesis
- Crecimiento en condiciones controladas
- Crecimiento en condiciones de asepsia
- Alta humedad relativa
- Estomas no funcionales
- Ausencia de pelos radiculares
- Ausencia de cera en la cutícula
IN VIVO:
- Realiza fotosíntesis
- Crecimiento en condiciones no controladas
- Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente
- Humedad relativa variable
- Estomas funcionales
- Presencia de pelos radiculares
- Presencia de cera en la cutícula
Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de
humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e
incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se
plantarán en contenedores (almacigueras)
cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La
elección de un sustrato con buenas
características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el
trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz
quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las
mezclas son diferentes y muy variadas de
acuerdo a la especie con la que estamos trabajando.
Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar
dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla
de sustratos seleccionada y cubiertos
con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las
almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual,
para mantener un ambiente húmedo a nivel
del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la
cobertura de nylon en las horas de menor calor( temprano en la mañana o en la
última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día
destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes
del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de
nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del
cultivo in vitro , generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos
de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser
muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.
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