La crioconservación, que describimos a continuación,
puede ser aplicada ventajosamente a la conservación de especies y variedades
vegetales silvestres o cultivadas como alternativa a las colecciones y bancos
de germoplasma clásicos (bancos de semillas, colecciones en campo). La
crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación,
mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas
condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno
líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una
serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos
filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética
del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan
el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in
vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos
fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento
de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de
espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en
pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros
cuadrados.
El elemento
fundamental de la crioconservación es el NL que se almacena y mantiene en
tanques especiales herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y
se evapore muy lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es
incoloro, inodoro y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a
presión atmosférica, por lo que el contacto con los tejidos provoca el
congelamiento del área. Es de fácil manejo pero, teniendo en cuenta que
desplaza el oxígeno del aire, hay que tener cuidado al manipularlo, lo que se
debe hacer en lugares bien ventilados.
El material
vegetal a utilizar puede proceder de cualquier parte de la planta: meristemos,
yemas, ápices, tallos, callos, embriones somáticos, etc. Debe ser selec-cionado
de plantas sanas y, en el caso de proceder de material de cultivo in vitro, los parámetros de
cultivo se deben optimizar antes de la crioconservación, ya que el éxito de
éste proceso de conservación va a depender tanto de los tratamientos utilizados
antes de someter al material al NL, como de los utilizados una vez recuperado
el material del NL. Por lo tanto, es de extrema importancia poner especial
atención en la composición de los medios de cultivo donde se incube el material
vegetal antes y después de introducirlo en NL para su conservación [Sakai y
cols., 1993,
Cryopreservation of Plant Genetic Resources 6: 5-26]. Para la
manipulación del material es necesario utilizar recipientes de materiales
resistentes a las bajas temperaturas, como los crioviales de polipropileno,
donde el material vegetal que queremos conservar se deposita antes de
introducirlo en el NL. Estos crioviales, con capacidades entre 1,2 y 15,0 ml,
tienen un sistema de cierre a rosca especialmente diseñado para soportar la
rápida conversión del NL a gas, que tiene lugar a temperatura ambiente,
conversión que de otro modo produciría la explosión del contenedor. Debido a la
facilidad con que se evapora el NL, es necesario controlar su nivel dentro de
los tanques donde se almacena, para reponer las pérdidas y mantener estable la
temperatura a –196 ºC y así asegurar la perfecta conservación del material.
Técnicas clásicas de crioconservación
- Enfriamiento lento hasta una temperatura definida, y luego inmersión en NL.
- ® Deshidratación se produce durante el congelamiento.
- ® Freezer programable.
- ® Exitoso en cultivos uniformes (protoplastos, suspensiones celulares).
Nuevas técnicas de crioconservación
- ® Deshidratación de las células previo al congelamiento.
- ® Sirve para órganos complejos (ápices, embriones).
- ® Mayor potencial de aplicación.
- ® Paso crítico: deshidratación.
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