3.4.3. FUSIÓN DE PROTOPLASTOS

Protoplastos:

El término de Protoplastos se refiere a componentes vivos de las células vegetales que están rodeados solo por la membrana plasmática; en realidad, constituyen células desnudas de una planta. Muchos Protoplastos pueden resintetizar la pared celular, dividirse, formar colonias e incluso regenerar plantas. La capacidad para producir un organismo altamente diferenciado, a partir de una sola célula somática, es una característica única de los Protoplastos de las plantas superiores.  Debido a la ausencia de la pared celular, los Protoplastos son adecuados para diversas y diferentes manipulaciones genéticas que no serian posibles con plantas o células intactas. Los Protoplastos sirven además como herramientas experimentales únicas para muchas investigaciones fisiológicas, biofísicas y bioquímicas.

El primer aislamiento de Protoplastos vivos fue el descrito por Klercker (1892), quien tuvo éxito al aislar Protoplastos de cebolla usando métodos mecánicos. El primer aislamiento por métodos enzimáticos se hizo en células de levadura, utilizando jugo gástrico de caracol Helix pomatia (Giaja, 1919); aunque en ese momento no se conocía el mecanismo de degradación enzimática de la pared celular, las observaciones de este trabajo fueron muy importantes ya que el método permitió aislar altas cantidades de Protoplastos. Cocking (1960) fue quien utilizo por primera vez degradantes de pared celular para aislar Protoplastos de plantas superiores; usando una preparación de celulasa cruda del hongo Myrothecium varrucaria, este investigador aisló Protoplastos de raíces de tomate.

Aislamiento de Protoplastos.

Aunque existe un método mecánico para aislar Protoplastos, el método enzimático es actualmente la forma más importante y efectiva para ese propósito. El método mecánico tiene un interés histórico, ya que su rendimiento es bajo, su procedimiento tedioso y su aplicación limitada, Dicho método consiste en aplicar un choque osmótico para producir plasmólisis en las células, las cuales se rompen luego mediante un corte; luego se pueden liberar los Protoplastos de las células rotas mediante el restablecimiento de su nivel osmótico. El método enzimático para el aislamiento de los Protoplastos consiste en incubar las células en una mezcla de enzimas que degradan la pared celular. Los principales factores que se deben considerar para el éxito de este método son:

a)    El tipo de enzimas que se usaran.

b)    La composición del medio en que ellas actuaran y

c)     El material de origen de los Protoplastos.

Enzimas para el aislamiento de Protoplastos.

Para el aislamiento de Protoplastos por el método enzimático es necesario usar mezclas de enzimas, en lugar de usarlas individualmente. Se utilizan enzimas de las siguientes clases generales: Celulasas, Hemicelulasas y Pectinasas, las cuales se obtienen generalmente de preparaciones comerciales; estas no son puras sino que contienen otras enzimas como proteasas, nucleasas y lipasas. Las enzimas que se usan para el aislamiento de Protoplastos son:

Celulasas:

®    Celulasas onuzuka R 10

®    Driselasa

®    Celulisina

®    Meicelasa

Hemicelulasas:

®    Rhozima HP 150

®    Hemicelulasa

Pectinasas:

®    Pectinasa

®    Macerozima R 10

®    Macerasa

®    Pectoliasa Y 23

Para utilizar las preparaciones enzimáticas comerciales en algunos tejidos, se aconseja eliminar de ellas las sales que continen; esto se puede hacer filtrándolas con una columna de Biogel o de Sephadex G25 o G50.

Resumen del libro digital de “CULTIVO DE TEJIDO VEGETAL” de  Roca W.M. y Mroginski L.A. Capitulo 10, pagina 240.