El mejoramiento tradicional de las especies, fue posible
gracias a varios factores tales como, la variabilidad genética existente entre
los organismos, la eficacia e intensidad de la selección aplicada, el tiempo
necesario para realizar un ciclo de selección y la heredabilidad del carácter que se quería
aislar, es decir qué porcentaje de las diferencias encontradas en un cierto carácter,
entre los individuos de una determinada población, se debe a diferencias en sus
genes. Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por responder: ¿cuántos genes
están implicados en la expresión de un carácter?, ¿cuál es el efecto de estos
genes?, ¿cuál es su localización y su función fisiológica?. Históricamente, la
taxonomía (o clasificación de organismos) ha estudiado características
fenotípicas, los cuales se evalúan mediante marcadores morfológicos. Estos
marcadores tienen la desventaja de que son limitados en número (las
características a medir no son infinitas), se deben medir en cierta etapa del
crecimiento y pueden estar influenciados por el ambiente. Así, los criterios
utilizados podrían carecer, en algunos casos, de definición y objetividad. Con
el advenimiento de la biología molecular, el desarrollo de los marcadores
moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección
basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de
especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva.
Los marcadores
moleculares y los marcadores genéticos
Una serie de técnicas moleculares de gran desarrollo en
los últimos treinta años permite conocer la información genética que poseen los
organismos. Se las conoce con el nombre de marcadores moleculares y
funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma. Los marcadores se
usan para el mapeo genético, como el primer paso para encontrar la posición e
identidad de un gen. Son ampliamente utilizados en estudios de genética humana,
vegetal, animal y microbiana. Los marcadores moleculares permiten evidenciar
variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos
individuos, modifiquen estas o no su fenotipo. Esto se debe a que los marcadores moleculares “señalan” tanto regiones
codificantes como no-codificantes del genoma.
1.- Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos
de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no
están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera
Mendeliana
2.- Un marcador
genético es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un
cromosoma y cuya herencia se puede rastrear. Para que una porción de ADN ligada al carácter de interés sea
considerado un marcador genético debe mostrar una variación
experimentalmente detectable entre los individuos de la población, y un modo de
herencia predecible según las leyes de Mendel. Esta variación puede ser
considerada a diferentes niveles biológicos, desde cambios fenotípicos heredables
significativos, hasta la variación de un solo nucleótido en la secuencia de ADN.
Un marcador ideal debe ser:
- altamente polimórfico o variable dentro y entre especies,
- de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes),
- insensible a los efectos ambientales,
- de rápida identificación y simple análisis
- de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo.
Tipos de marcadores genéticos
En los análisis
genómicos, se han utilizado varios tipos de marcadores: morfológicos, isoenzimas,
proteínas y marcadores basados en ADN.
Marcadores morfológicos
Son características fenotípicas
de fácil identificación visual tales como forma, color, tamaño o altura. Muchos
de ellos se convierten en importantes “descriptores”, a la hora de inscribir
nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plántula, tallo,
hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar
variedades de trigo en la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y
Alimentación (SAGPyA). Como se describió anteriormente,
los marcadores morfológicos presentan algunas limitaciones, no obstante
permanecen como caracteres útiles en la identificación de materiales dado que
representan un conjunto de caracteres que pueden ser evaluados con métodos
sencillos y a bajo costo.
Isoenzimas
Se definen como diferentes formas
moleculares de un tipo de enzima, que poseen una actividad catalítica común, es
decir actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en la secuencia de ADN
(mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios en la
composición de aminoácidos. Si estos cambios se producen, las proteínas podrían
tener la misma actividad biológica, pero como su composición de aminoácidos
varía, podrían tener diferente carga neta y por tanto diferentes velocidades de
migración en un campo eléctrico. Estas diferencias determinan patrones
característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas. Las
enzimas que se utilizan en estos estudios se clasifican de acuerdo a su función
y se representan con una sigla de tres letras. Por ejemplo:
- dehidrogenasas
(alcohol dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH),
- oxidasas
(peroxidasas PRX),
- hidrolasas
(fosfatasas ácidas ACP, esterasas EST),
- isomerasas
(fosfoglucoisomerasa PGI)
- transferasas
(fosfoglucomutasas PGM).
Las isoenzimas han tenido un rol
prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y
estructura genética, sistemática y biología evolutiva así como en descripción
de germoplasma e identificación de variedades.
Proteínas de reserva
El endosperma de los cereales es
el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el
80-90% de su peso seco. Almidón y proteínas son las dos macromoléculas más
importantes. El contenido de proteína varía según la especie, por ejemplo, los
valores más altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los más bajos en maíz y
arroz (6%). La concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente
menor que en las leguminosas ya que en éstas los órganos de reserva o
cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en proteínas. Las proteínas del endosperma
fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por el químico Osborne
(Metodología de Osborne& Mendel), quien dio las bases para las
clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en
diferentes solventes: albúminas solubles en agua, globulinas en solución
salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en ácidos o álcalis. El uso de
proteínas de almacenamiento en estudios de diversidad genética sistemática, se
basa en el hecho que las proteínas de diferentes individuos, poblaciones y
especies son homólogas, y que al separarse en un gel producirán bandas
similares o diferentes. Debido a que las proteínas de reserva carecen de
actividad enzimática, ellas son detectadas en el gel por medio de técnicas
generales de teñido.
ADN y marcadores moleculares
Un marcador de ADN es simplemente
un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen.
Existen diversas técnicas de biología molecular disponibles para detectar
variabilidad en la secuencia de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), las enzimas de restricción, la separación electroforética de los
fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las técnicas que permiten
obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares. y cubrir la
totalidad del genoma de un organismo. Los marcadores moleculares pueden ser
clasificados en tres grupos:
Grupo 1: Marcadores basados en
la hibrididación del ADN
Estos tipos de marcadores
involucran la detección de un segmento específico (marcador) en el ADN de
estudio por hibridación con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia
complementaria al marcador (sonda). Esto implica que el investigador que busca
estudiar un gen de interés, debe conocer al menos una parte de su secuencia,
para poder construir una porción complementaria (sonda) que permita “pescar” a
ese gen de interés. Dentro de este grupo de marcadores se encuentran los RFLP y
los VNTR o minisatélites.
Las secuencias de ADN de minisatélites (VNTR) son secuencias
repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tandem (una detrás de la otra) y
dispersas a través del genoma. Cada VNTR tiene distinto número de
repeticiones variable, asociándose de esta manera un tamaño distinto a cada
alelo. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridación o por
técnicas de PCR.
Grupo 2: Marcadores basados en
la amplificación del ADN
En este grupo se incluyen
aquellos marcadores moleculares en los que se utiliza la reacción de PCR (polymerasechainreaction) o reacción en cadena de la polimerasa de
ADN. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de
copias de un segmento específico de ADN . Son muchos los marcadores moleculares
que están incluidos en este grupo, entre los que se encuentran los
microsatélites o SSR, los RAPDs y CAPs.
Grupo 3: Marcadores mixtos
Son aquellos que resultan de la
combinación de otros tipos de marcadores moleculares. Entre ellos se encuentran
los AFLP, unos de los más utilizados en estos tipos de estudios.
De la descripción realizada, se desprende que los marcadores varían
ampliamente en el grado de complejidad del método, el nivel de polimorfismo y
en los factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del
estudio incluyen el análisis de un número elevado de individuos. Estos son
algunos de los aspectos importantes a tener en cuenta a la hora de elegir el
tipo de marcador a utilizar en una determinada investigación científica.
Aplicaciones de los marcadores
moleculares
Son múltiples las aplicaciones de
los marcadores moleculares en el estudio de especies vegetales, animales,
microbianas e incluso en el área de los alimentos.
Utilización de los marcadores moleculares:
Las herramientas descriptas
anteriormente se utilizan en numerosas áreas relacionadas con el mejoramiento
vegetal y el análisis de la biodiversidad. A continuación se describen algunas
de estas aplicaciones:
ü Identificación
de genotipos – Pureza varietal
El control de la pureza varietal
y la discriminación de variedades protegidas (es decir, registradas) requieren
de una adecuada identificación de los materiales. Esta identificación se basa
tradicionalmente en el uso de descriptores morfológicos y fisiológicos. Sin
embargo, varios de los caracteres usados como descriptores presentan
limitaciones en cuanto al número restringido de variantes, influencia ambiental
y dependencia del estadio de desarrollo de planta. Como alternativa para
resolver estos problemas, los polimorfismos
moleculares de proteínas y ADNresultan de utilidad en la determinación
de los criterios DUS (distinción, uniformidad y estabilidad). Se
utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfológicos
y fisiológicos para el registro de los cultivares.
ü Uso
en bancos de germoplasma
Los marcadores moleculares
permiten caracterizar las accesioneso muestras a ser
incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticación, establecer
relaciones filogenéticas y colaborar en la elección de las estrategias de
conservación en los Bancos de germoplasma.
ü Mapeo
genético
Un mapa genéticode una especie muestra la distribución linear de un
grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el
genoma de un organismo. El objetivo es encontrar aquellos marcadores
moleculares que estén “ligados” a un gen de interés (es decir, que estén lo
suficientemente cerca como para que segreguen juntos en la meiosis). Así, si un
marcador resulta estar genéticamente ligado a un gen que controla un carácter
de interés agronómico, la selección de este marcador resulta en la selección
indirecta del gen de interés. Este hecho constituye el fundamento del proceso
denominado selección asistida por marcadores moleculares (MAS), aplicado
en el mejoramiento genético vegetal y animal. Cuanto más próximos estén el
marcador y el gen en cuestión, más eficiente será la selección.
ü Mapeo
comparativo
La comparación de mapas de
ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Si
un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de
ligamiento entre dos especies se dice que muestran sintenia. Diversos estudios en diferentes grupos taxonómicos
mostraron una estrecha relación entre los genomas de las especies comprendidas
dentro de cada grupo. Esto se ha observado, por ejemplo, entre especies
pertenecientes a las Solanáceas (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsisy
cultivos del género Brassica, y dentro de las gramíneas entre especies
pertenecientes a la tribu Triticeas(trigo, cebada, centeno) así como
entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonómicas, tal el caso
de arroz, maíz y sorgo.
ü Distribución
de la variabilidad genética en poblaciones naturales
Las especies están constituidas
por unidades más o menos aisladas denominadas poblaciones. Una especie vegetal raramente se
extiende en forma continua e ininterrumpida. En general adopta una distribución en parches. El número de
individuos en cada población, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las
distancias entre poblaciones, el tipo de polinización
(gravedad-anemófila-entomófila), la acción del hombre en la fragmentación del
hábitat y el origen histórico (especies nativas-especies introducidas)
determinan en conjunto una distribución de la variación genética propia de cada
especie. Los proyectos destinados a la
conservación de especies naturales, tienen como objetivo seleccionar
poblaciones que formarán parte de las áreas protegidas, las cuales deberán
contener la mayor diversidad genética posible de modo de asegurar el mayor
potencial evolutivo. Los marcadores moleculares permiten establecer la
diversidad genética existente en estas poblaciones.
ü Estimación
del flujo génico
El flujo génico entre poblaciones
vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfología
de semilla y polen, los mecanismos de dispersión, el tipo de polinización,
etc., hacen que la contribución de estas dos vías al flujo total varíe de
acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares permiten cuantificar cada uno
de estos procesos.
En resumen, en los últimos
treinta años se produjeron grandes avances en biología molecular que
permitieron el desarrollo de técnicas moleculares que admiten analizar en forma
rápida y precisa el genoma de los seres vivos. A través de estas técnicas se
obtuvieron gran cantidad de marcadores moleculares dispersos a lo largo de todo
el genoma, se construyeron mapas genéticos de diversas especies, y se ubicaron
genes de resistencia a enfermedades, plagas, etc. Los marcadores ligados a
genes de interés agronómico se pueden utilizar para realizar selección
genotípica temprana, en plántulas, y de esta manera se evita manejar cientos o
miles de plantas en la selección fenotípica en invernáculo o a campo. La
selección asistida por marcadores moleculares es una herramienta muy
interesante para los planes de mejoramiento, ya que permite acelerar la
selección y disminuir los costos en el manejo de grandes poblaciones de
plantas.