5.1.3. marcadores moleculares

El mejoramiento tradicional de las especies, fue posible gracias a varios factores tales como, la variabilidad genética existente entre los organismos, la eficacia e intensidad de la selección aplicada, el tiempo necesario para realizar un ciclo de selección y la  heredabilidad del carácter que se quería aislar, es decir qué porcentaje de las diferencias encontradas en un cierto carácter, entre los individuos de una determinada población, se debe a diferencias en sus genes. Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por responder: ¿cuántos genes están implicados en la expresión de un carácter?, ¿cuál es el efecto de estos genes?, ¿cuál es su localización y su función fisiológica?. Históricamente, la taxonomía (o clasificación de organismos) ha estudiado características fenotípicas, los cuales se evalúan mediante marcadores morfológicos. Estos marcadores tienen la desventaja de que son limitados en número (las características a medir no son infinitas), se deben medir en cierta etapa del crecimiento y pueden estar influenciados por el ambiente. Así, los criterios utilizados podrían carecer, en algunos casos, de definición y objetividad. Con el advenimiento de la biología molecular, el desarrollo de los marcadores moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva.

Los marcadores moleculares y los marcadores genéticos

Una serie de técnicas moleculares de gran desarrollo en los últimos treinta años permite conocer la información genética que poseen los organismos. Se las conoce con el nombre de marcadores moleculares y funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma. Los marcadores se usan para el mapeo genético, como el primer paso para encontrar la posición e identidad de un gen. Son ampliamente utilizados en estudios de genética humana, vegetal, animal y microbiana. Los marcadores moleculares permiten evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, modifiquen estas o no su fenotipo. Esto se debe a que los marcadores moleculares “señalan” tanto regiones codificantes como no-codificantes del genoma.

1.- Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera Mendeliana

2.- Un marcador genético es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un cromosoma y cuya herencia se puede rastrear. Para que una porción de ADN ligada al carácter de interés sea considerado un marcador genético debe mostrar una variación experimentalmente detectable entre los individuos de la población, y un modo de herencia predecible según las leyes de Mendel. Esta variación puede ser considerada a diferentes niveles biológicos, desde cambios fenotípicos heredables significativos, hasta la variación de un solo nucleótido en la secuencia de ADN. Un marcador ideal debe ser:

• altamente polimórfico o variable dentro y entre especies,
• de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes),
• insensible a los efectos ambientales,
• de rápida identificación y simple análisis
• de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo.

Tipos de marcadores genéticos

En los análisis genómicos, se han utilizado varios tipos de marcadores: morfológicos, isoenzimas, proteínas y marcadores basados en ADN.

Marcadores morfológicos

Son características fenotípicas de fácil identificación visual tales como forma, color, tamaño o altura. Muchos de ellos se convierten en importantes “descriptores”, a la hora de inscribir nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plántula, tallo, hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar variedades de trigo en la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y Alimentación (SAGPyA). Como se describió anteriormente, los marcadores morfológicos presentan algunas limitaciones, no obstante permanecen como caracteres útiles en la identificación de materiales dado que representan un conjunto de caracteres que pueden ser evaluados con métodos sencillos y a bajo costo.

Isoenzimas

Se definen como diferentes formas moleculares de un tipo de enzima, que poseen una actividad catalítica común, es decir actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en la secuencia de ADN (mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios en la composición de aminoácidos. Si estos cambios se producen, las proteínas podrían tener la misma actividad biológica, pero como su composición de aminoácidos varía, podrían tener diferente carga neta y por tanto diferentes velocidades de migración en un campo eléctrico. Estas diferencias determinan patrones característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas. Las enzimas que se utilizan en estos estudios se clasifican de acuerdo a su función y se representan con una sigla de tres letras. Por ejemplo:

-      dehidrogenasas (alcohol dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH),

-      oxidasas (peroxidasas PRX),

-      hidrolasas (fosfatasas ácidas ACP, esterasas EST),

-      isomerasas (fosfoglucoisomerasa PGI)

-      transferasas (fosfoglucomutasas PGM).

Las isoenzimas han tenido un rol prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y estructura genética, sistemática y biología evolutiva así como en descripción de germoplasma e identificación de variedades.

Proteínas de reserva

El endosperma de los cereales es el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el 80-90% de su peso seco. Almidón y proteínas son las dos macromoléculas más importantes. El contenido de proteína varía según la especie, por ejemplo, los valores más altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los más bajos en maíz y arroz (6%). La concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente menor que en las leguminosas ya que en éstas los órganos de reserva o cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en proteínas. Las proteínas del endosperma fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por el químico Osborne (Metodología de Osborne& Mendel), quien dio las bases para las clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en diferentes solventes: albúminas solubles en agua, globulinas en solución salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en ácidos o álcalis. El uso de proteínas de almacenamiento en estudios de diversidad genética sistemática, se basa en el hecho que las proteínas de diferentes individuos, poblaciones y especies son homólogas, y que al separarse en un gel producirán bandas similares o diferentes. Debido a que las proteínas de reserva carecen de actividad enzimática, ellas son detectadas en el gel por medio de técnicas generales de teñido.

ADN y marcadores moleculares

Un marcador de ADN es simplemente un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen. Existen diversas técnicas de biología molecular disponibles para detectar variabilidad en la secuencia de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las enzimas de restricción, la separación electroforética de los fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones  son algunas de las técnicas que permiten obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares. y cubrir la totalidad del genoma de un organismo. Los marcadores moleculares pueden ser clasificados en tres grupos:

Grupo 1: Marcadores basados en la hibrididación del ADN

Estos tipos de marcadores involucran la detección de un segmento específico (marcador) en el ADN de estudio por hibridación con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia complementaria al marcador (sonda). Esto implica que el investigador que busca estudiar un gen de interés, debe conocer al menos una parte de su secuencia, para poder construir una porción complementaria (sonda) que permita “pescar” a ese gen de interés. Dentro de este grupo de marcadores se encuentran los RFLP y los VNTR o minisatélites.  

Las secuencias de ADN de minisatélites (VNTR) son secuencias repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tandem (una detrás de la otra) y dispersas a través del genoma. Cada VNTR tiene distinto número de repeticiones variable, asociándose de esta manera un tamaño distinto a cada alelo. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridación o por técnicas de PCR.

Grupo 2: Marcadores basados en la amplificación del ADN

En este grupo se incluyen aquellos marcadores moleculares en los que se utiliza la reacción de PCR (polymerasechainreaction) o reacción en cadena de la polimerasa de ADN. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de copias de un segmento específico de ADN . Son muchos los marcadores moleculares que están incluidos en este grupo, entre los que se encuentran los microsatélites o SSR, los RAPDs y CAPs.

Grupo 3: Marcadores mixtos

Son aquellos que resultan de la combinación de otros tipos de marcadores moleculares. Entre ellos se encuentran los AFLP, unos de los más utilizados en estos tipos de estudios.

De la descripción realizada, se desprende que los marcadores varían ampliamente en el grado de complejidad del método, el nivel de polimorfismo y en los factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del estudio incluyen el análisis de un número elevado de individuos. Estos son algunos de los aspectos importantes a tener en cuenta a la hora de elegir el tipo de marcador a utilizar en una determinada investigación científica.

Aplicaciones de los marcadores moleculares

Son múltiples las aplicaciones de los marcadores moleculares en el estudio de especies vegetales, animales, microbianas e incluso en el área de los alimentos.

Utilización de los marcadores moleculares:

Las herramientas descriptas anteriormente se utilizan en numerosas áreas relacionadas con el mejoramiento vegetal y el análisis de la biodiversidad. A continuación se describen algunas de estas aplicaciones:

ü  Identificación de genotipos – Pureza varietal

El control de la pureza varietal y la discriminación de variedades protegidas (es decir, registradas) requieren de una adecuada identificación de los materiales. Esta identificación se basa tradicionalmente en el uso de descriptores morfológicos y fisiológicos. Sin embargo, varios de los caracteres usados como descriptores presentan limitaciones en cuanto al número restringido de variantes, influencia ambiental y dependencia del estadio de desarrollo de planta. Como alternativa para resolver estos problemas, los polimorfismos moleculares de proteínas y ADNresultan de utilidad en la determinación de los criterios DUS (distinción, uniformidad y estabilidad). Se utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfológicos y fisiológicos para el registro de los cultivares.

ü  Uso en bancos de germoplasma

Los marcadores moleculares permiten caracterizar las accesioneso muestras a ser incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticación, establecer relaciones filogenéticas y colaborar en la elección de las estrategias de conservación en los Bancos de germoplasma.

ü  Mapeo genético

Un mapa genéticode una especie muestra la distribución linear de un grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el genoma de un organismo. El objetivo es encontrar aquellos marcadores moleculares que estén “ligados” a un gen de interés (es decir, que estén lo suficientemente cerca como para que segreguen juntos en la meiosis). Así, si un marcador resulta estar genéticamente ligado a un gen que controla un carácter de interés agronómico, la selección de este marcador resulta en la selección indirecta del gen de interés. Este hecho constituye el fundamento del proceso denominado selección asistida por marcadores moleculares (MAS), aplicado en el mejoramiento genético vegetal y animal. Cuanto más próximos estén el marcador y el gen en cuestión, más eficiente será la selección.

ü  Mapeo comparativo

La comparación de mapas de ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Si un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de ligamiento entre dos especies se dice que muestran sintenia. Diversos estudios en diferentes grupos taxonómicos mostraron una estrecha relación entre los genomas de las especies comprendidas dentro de cada grupo. Esto se ha observado, por ejemplo, entre especies pertenecientes a las Solanáceas (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsisy cultivos del género Brassica, y dentro de las gramíneas entre especies pertenecientes a la tribu Triticeas(trigo, cebada, centeno) así como entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonómicas, tal el caso de arroz, maíz y sorgo.      

ü  Distribución de la variabilidad genética en poblaciones naturales

Las especies están constituidas por unidades más o menos aisladas denominadas poblaciones. Una especie vegetal raramente se extiende en forma continua e ininterrumpida. En general adopta una distribución en parches. El número de individuos en cada población, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las distancias entre poblaciones, el tipo de polinización (gravedad-anemófila-entomófila), la acción del hombre en la fragmentación del hábitat y el origen histórico (especies nativas-especies introducidas) determinan en conjunto una distribución de la variación genética propia de cada especie. Los proyectos destinados a la conservación de especies naturales, tienen como objetivo seleccionar poblaciones que formarán parte de las áreas protegidas, las cuales deberán contener la mayor diversidad genética posible de modo de asegurar el mayor potencial evolutivo. Los marcadores moleculares permiten establecer la diversidad genética existente en estas poblaciones.

ü  Estimación del flujo génico

El flujo génico entre poblaciones vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfología de semilla y polen, los mecanismos de dispersión, el tipo de polinización, etc., hacen que la contribución de estas dos vías al flujo total varíe de acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares permiten cuantificar cada uno de estos procesos.

En resumen, en los últimos treinta años se produjeron grandes avances en biología molecular que permitieron el desarrollo de técnicas moleculares que admiten analizar en forma rápida y precisa el genoma de los seres vivos. A través de estas técnicas se obtuvieron gran cantidad de marcadores moleculares dispersos a lo largo de todo el genoma, se construyeron mapas genéticos de diversas especies, y se ubicaron genes de resistencia a enfermedades, plagas, etc. Los marcadores ligados a genes de interés agronómico se pueden utilizar para realizar selección genotípica temprana, en plántulas, y de esta manera se evita manejar cientos o miles de plantas en la selección fenotípica en invernáculo o a campo. La selección asistida por marcadores moleculares es una herramienta muy interesante para los planes de mejoramiento, ya que permite acelerar la selección y disminuir los costos en el manejo de grandes poblaciones de plantas.