- Usa cebadores cortos (normalmente 10 bases).
- Amplifica regiones anónimas de ADN.
Los pasos involucrados en el laboratorio son:
1.- extracción del ADN
2.- reacción de PCR con un cebador al azar
3.- Separacion de los fragmentos de DNA
lunes, 10 de diciembre de 2012
5.1.3.2. RAPD
características:
5.1.3.1. AFLP
Dentro de los marcadores
moleculares mixtos se encuentran los AFLP, unos de los más utilizados en estos
tipos de estudios. El AFLP consiste en amplificar en forma selectiva fragmentos
de ADN cortados con enzimas de restricción. El ADN de las individuos a analizar
se corta con dos enzimas de restricción distintas y luego se le ligan
“adaptadores” a los extremos de los fragmentos de ADN resultantes de dicha
digestión, que permite que se amplifiquen en forma selectiva algunos de esos
fragmentos que tienen las bases suplementadas a los cebadores o primers utilizados. La separación de
estos fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida genera entre 50
y 100 fragmentos. La ventaja de este método radica en que se puede analizar, en
un solo ensayo, un gran número de regiones
del genoma.
5.1.3. marcadores moleculares
El mejoramiento tradicional de las especies, fue posible
gracias a varios factores tales como, la variabilidad genética existente entre
los organismos, la eficacia e intensidad de la selección aplicada, el tiempo
necesario para realizar un ciclo de selección y la heredabilidad del carácter que se quería
aislar, es decir qué porcentaje de las diferencias encontradas en un cierto carácter,
entre los individuos de una determinada población, se debe a diferencias en sus
genes. Sin embargo, aún quedan muchas preguntas por responder: ¿cuántos genes
están implicados en la expresión de un carácter?, ¿cuál es el efecto de estos
genes?, ¿cuál es su localización y su función fisiológica?. Históricamente, la
taxonomía (o clasificación de organismos) ha estudiado características
fenotípicas, los cuales se evalúan mediante marcadores morfológicos. Estos
marcadores tienen la desventaja de que son limitados en número (las
características a medir no son infinitas), se deben medir en cierta etapa del
crecimiento y pueden estar influenciados por el ambiente. Así, los criterios
utilizados podrían carecer, en algunos casos, de definición y objetividad. Con
el advenimiento de la biología molecular, el desarrollo de los marcadores
moleculares está ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una selección
basada en el análisis exclusivo del fenotipo, como la identificación de
especies y variedades de una forma más rigurosa y repetitiva.
Los marcadores
moleculares y los marcadores genéticos
Una serie de técnicas moleculares de gran desarrollo en
los últimos treinta años permite conocer la información genética que poseen los
organismos. Se las conoce con el nombre de marcadores moleculares y
funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma. Los marcadores se
usan para el mapeo genético, como el primer paso para encontrar la posición e
identidad de un gen. Son ampliamente utilizados en estudios de genética humana,
vegetal, animal y microbiana. Los marcadores moleculares permiten evidenciar
variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos
individuos, modifiquen estas o no su fenotipo. Esto se debe a que los marcadores moleculares “señalan” tanto regiones
codificantes como no-codificantes del genoma.
1.- Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos
de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no
están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera
Mendeliana
2.- Un marcador
genético es un segmento de ADN con una ubicación física identificable en un
cromosoma y cuya herencia se puede rastrear. Para que una porción de ADN ligada al carácter de interés sea
considerado un marcador genético debe mostrar una variación
experimentalmente detectable entre los individuos de la población, y un modo de
herencia predecible según las leyes de Mendel. Esta variación puede ser
considerada a diferentes niveles biológicos, desde cambios fenotípicos heredables
significativos, hasta la variación de un solo nucleótido en la secuencia de ADN.
Un marcador ideal debe ser:
- altamente polimórfico o variable dentro y entre especies,
- de herencia mendeliana no epistática (sin interacción entre genes),
- insensible a los efectos ambientales,
- de rápida identificación y simple análisis
- de posible detección en los estadios tempranos del desarrollo.
Tipos de marcadores genéticos
En los análisis
genómicos, se han utilizado varios tipos de marcadores: morfológicos, isoenzimas,
proteínas y marcadores basados en ADN.
Marcadores morfológicos
Son características fenotípicas
de fácil identificación visual tales como forma, color, tamaño o altura. Muchos
de ellos se convierten en importantes “descriptores”, a la hora de inscribir
nuevas variedades. Por ejemplo, alrededor de 50 caracteres de plántula, tallo,
hoja, espiga, espiguilla y cariopse se utilizan para inscribir e identificar
variedades de trigo en la Secretaría de Agricultura Ganadería Pesca y
Alimentación (SAGPyA). Como se describió anteriormente,
los marcadores morfológicos presentan algunas limitaciones, no obstante
permanecen como caracteres útiles en la identificación de materiales dado que
representan un conjunto de caracteres que pueden ser evaluados con métodos
sencillos y a bajo costo.
Isoenzimas
Se definen como diferentes formas
moleculares de un tipo de enzima, que poseen una actividad catalítica común, es
decir actúan sobre el mismo sustrato. Ciertos cambios en la secuencia de ADN
(mutaciones) que codifica para estas enzimas pueden resultar en cambios en la
composición de aminoácidos. Si estos cambios se producen, las proteínas podrían
tener la misma actividad biológica, pero como su composición de aminoácidos
varía, podrían tener diferente carga neta y por tanto diferentes velocidades de
migración en un campo eléctrico. Estas diferencias determinan patrones
característicos de migración electroforética de las formas iso-enzimáticas. Las
enzimas que se utilizan en estos estudios se clasifican de acuerdo a su función
y se representan con una sigla de tres letras. Por ejemplo:
- dehidrogenasas
(alcohol dehidrogenasa ADH, glutamato dehidrogenasa GDH),
- oxidasas
(peroxidasas PRX),
- hidrolasas
(fosfatasas ácidas ACP, esterasas EST),
- isomerasas
(fosfoglucoisomerasa PGI)
- transferasas
(fosfoglucomutasas PGM).
Las isoenzimas han tenido un rol
prominente en estudios de poblaciones vegetales para determinar variabilidad y
estructura genética, sistemática y biología evolutiva así como en descripción
de germoplasma e identificación de variedades.
Proteínas de reserva
El endosperma de los cereales es
el principal componente de la semilla ya que representa aproximadamente el
80-90% de su peso seco. Almidón y proteínas son las dos macromoléculas más
importantes. El contenido de proteína varía según la especie, por ejemplo, los
valores más altos se dan en trigo y avena (10-17%) y los más bajos en maíz y
arroz (6%). La concentración de proteínas en los cereales es apreciablemente
menor que en las leguminosas ya que en éstas los órganos de reserva o
cotiledones son capaces de almacenar hasta un 40% de su peso seco en proteínas. Las proteínas del endosperma
fueron estudiadas ya a comienzos del siglo pasado por el químico Osborne
(Metodología de Osborne& Mendel), quien dio las bases para las
clasificaciones actuales. La misma se basa en la solubilidad relativa en
diferentes solventes: albúminas solubles en agua, globulinas en solución
salina, prolaminas en alcohol y glutelinas en ácidos o álcalis. El uso de
proteínas de almacenamiento en estudios de diversidad genética sistemática, se
basa en el hecho que las proteínas de diferentes individuos, poblaciones y
especies son homólogas, y que al separarse en un gel producirán bandas
similares o diferentes. Debido a que las proteínas de reserva carecen de
actividad enzimática, ellas son detectadas en el gel por medio de técnicas
generales de teñido.
ADN y marcadores moleculares
Un marcador de ADN es simplemente
un punto de referencia en un cromosoma, que puede o no corresponder a un gen.
Existen diversas técnicas de biología molecular disponibles para detectar
variabilidad en la secuencia de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), las enzimas de restricción, la separación electroforética de los
fragmentos de ADN, las sondas marcadas y las hibridizaciones son algunas de las técnicas que permiten
obtener un número virtualmente ilimitado de marcadores moleculares. y cubrir la
totalidad del genoma de un organismo. Los marcadores moleculares pueden ser
clasificados en tres grupos:
Grupo 1: Marcadores basados en
la hibrididación del ADN
Estos tipos de marcadores
involucran la detección de un segmento específico (marcador) en el ADN de
estudio por hibridación con un fragmento marcado radiactivamente de secuencia
complementaria al marcador (sonda). Esto implica que el investigador que busca
estudiar un gen de interés, debe conocer al menos una parte de su secuencia,
para poder construir una porción complementaria (sonda) que permita “pescar” a
ese gen de interés. Dentro de este grupo de marcadores se encuentran los RFLP y
los VNTR o minisatélites.
Las secuencias de ADN de minisatélites (VNTR) son secuencias
repetidas que se presentan en eucariontes. Ellas se encuentran repetidas en tandem (una detrás de la otra) y
dispersas a través del genoma. Cada VNTR tiene distinto número de
repeticiones variable, asociándose de esta manera un tamaño distinto a cada
alelo. Existen dos formas de detectar los VNTR ya sea por hibridación o por
técnicas de PCR.
Grupo 2: Marcadores basados en
la amplificación del ADN
En este grupo se incluyen
aquellos marcadores moleculares en los que se utiliza la reacción de PCR (polymerasechainreaction) o reacción en cadena de la polimerasa de
ADN. Esta técnica se basa en la síntesis enzimática de millones de
copias de un segmento específico de ADN . Son muchos los marcadores moleculares
que están incluidos en este grupo, entre los que se encuentran los
microsatélites o SSR, los RAPDs y CAPs.
Grupo 3: Marcadores mixtos
Son aquellos que resultan de la
combinación de otros tipos de marcadores moleculares. Entre ellos se encuentran
los AFLP, unos de los más utilizados en estos tipos de estudios.
De la descripción realizada, se desprende que los marcadores varían
ampliamente en el grado de complejidad del método, el nivel de polimorfismo y
en los factores costo y tiempo, de gran importancia cuando los objetivos del
estudio incluyen el análisis de un número elevado de individuos. Estos son
algunos de los aspectos importantes a tener en cuenta a la hora de elegir el
tipo de marcador a utilizar en una determinada investigación científica.
Aplicaciones de los marcadores
moleculares
Son múltiples las aplicaciones de
los marcadores moleculares en el estudio de especies vegetales, animales,
microbianas e incluso en el área de los alimentos.
Utilización de los marcadores moleculares:
Las herramientas descriptas
anteriormente se utilizan en numerosas áreas relacionadas con el mejoramiento
vegetal y el análisis de la biodiversidad. A continuación se describen algunas
de estas aplicaciones:
ü Identificación
de genotipos – Pureza varietal
El control de la pureza varietal
y la discriminación de variedades protegidas (es decir, registradas) requieren
de una adecuada identificación de los materiales. Esta identificación se basa
tradicionalmente en el uso de descriptores morfológicos y fisiológicos. Sin
embargo, varios de los caracteres usados como descriptores presentan
limitaciones en cuanto al número restringido de variantes, influencia ambiental
y dependencia del estadio de desarrollo de planta. Como alternativa para
resolver estos problemas, los polimorfismos
moleculares de proteínas y ADNresultan de utilidad en la determinación
de los criterios DUS (distinción, uniformidad y estabilidad). Se
utilizan localmente como datos complementarios de los descriptores morfológicos
y fisiológicos para el registro de los cultivares.
ü Uso
en bancos de germoplasma
Los marcadores moleculares
permiten caracterizar las accesioneso muestras a ser
incluidas en las colecciones, estudiar el proceso de domesticación, establecer
relaciones filogenéticas y colaborar en la elección de las estrategias de
conservación en los Bancos de germoplasma.
ü Mapeo
genético
Un mapa genéticode una especie muestra la distribución linear de un
grupo de genes y marcadores en cada uno de los cromosomas que constituyen el
genoma de un organismo. El objetivo es encontrar aquellos marcadores
moleculares que estén “ligados” a un gen de interés (es decir, que estén lo
suficientemente cerca como para que segreguen juntos en la meiosis). Así, si un
marcador resulta estar genéticamente ligado a un gen que controla un carácter
de interés agronómico, la selección de este marcador resulta en la selección
indirecta del gen de interés. Este hecho constituye el fundamento del proceso
denominado selección asistida por marcadores moleculares (MAS), aplicado
en el mejoramiento genético vegetal y animal. Cuanto más próximos estén el
marcador y el gen en cuestión, más eficiente será la selección.
ü Mapeo
comparativo
La comparación de mapas de
ligamiento entre diferentes especies se denomina mapeo comparativo. Si
un grupo de marcadores moleculares mantiene el orden y sus relaciones de
ligamiento entre dos especies se dice que muestran sintenia. Diversos estudios en diferentes grupos taxonómicos
mostraron una estrecha relación entre los genomas de las especies comprendidas
dentro de cada grupo. Esto se ha observado, por ejemplo, entre especies
pertenecientes a las Solanáceas (tomate, papa, pimiento), entre Arabidopsisy
cultivos del género Brassica, y dentro de las gramíneas entre especies
pertenecientes a la tribu Triticeas(trigo, cebada, centeno) así como
entre especies pertenecientes a distintas subfamilias taxonómicas, tal el caso
de arroz, maíz y sorgo.
ü Distribución
de la variabilidad genética en poblaciones naturales
Las especies están constituidas
por unidades más o menos aisladas denominadas poblaciones. Una especie vegetal raramente se
extiende en forma continua e ininterrumpida. En general adopta una distribución en parches. El número de
individuos en cada población, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), las
distancias entre poblaciones, el tipo de polinización
(gravedad-anemófila-entomófila), la acción del hombre en la fragmentación del
hábitat y el origen histórico (especies nativas-especies introducidas)
determinan en conjunto una distribución de la variación genética propia de cada
especie. Los proyectos destinados a la
conservación de especies naturales, tienen como objetivo seleccionar
poblaciones que formarán parte de las áreas protegidas, las cuales deberán
contener la mayor diversidad genética posible de modo de asegurar el mayor
potencial evolutivo. Los marcadores moleculares permiten establecer la
diversidad genética existente en estas poblaciones.
ü Estimación
del flujo génico
El flujo génico entre poblaciones
vegetales ocurre mediante el movimiento de polen o de semillas. La morfología
de semilla y polen, los mecanismos de dispersión, el tipo de polinización,
etc., hacen que la contribución de estas dos vías al flujo total varíe de
acuerdo a la especie. Los marcadores moleculares permiten cuantificar cada uno
de estos procesos.
En resumen, en los últimos
treinta años se produjeron grandes avances en biología molecular que
permitieron el desarrollo de técnicas moleculares que admiten analizar en forma
rápida y precisa el genoma de los seres vivos. A través de estas técnicas se
obtuvieron gran cantidad de marcadores moleculares dispersos a lo largo de todo
el genoma, se construyeron mapas genéticos de diversas especies, y se ubicaron
genes de resistencia a enfermedades, plagas, etc. Los marcadores ligados a
genes de interés agronómico se pueden utilizar para realizar selección
genotípica temprana, en plántulas, y de esta manera se evita manejar cientos o
miles de plantas en la selección fenotípica en invernáculo o a campo. La
selección asistida por marcadores moleculares es una herramienta muy
interesante para los planes de mejoramiento, ya que permite acelerar la
selección y disminuir los costos en el manejo de grandes poblaciones de
plantas.
viernes, 7 de diciembre de 2012
5.1.2. Northern
La hibridación
Northern se utiliza para la detcción de RNA. El ARN celular se extrae y
se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente
se hibridan con sondas ARN antisense o ADN. En
todos los sistemas de hibridación el ácido nucléico diana está localizado en un
soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido citológico, en los
procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra
disuelto en un líquido.
El procedimiento es similar al de southern pero no se desnaturaliza ya que la cadena es ARN y es fragil.
apuntes de la clase de biotecnologia vegetal del dia 5 de diciembre del 2012
5.1.1. Southern
Hibridación
Southernblot (SB). Necesita
de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación
de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de
endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta
los genomas en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón
característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una
separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales
pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se
transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de
referencia actual de. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier
otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el
único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal
o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran
complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no
fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se
reduce muy notablemente.
APUNTES DE LA CLASE DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL
5.1. TECNICAS BASADAS EN PCR Y/O ELECTROFORESIS
la hibridación de acidos nucleicos
Es un
proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo
origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la
sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana.
¿Qué es una sonda?
Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA
marcado con una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento
específico de una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena
sencilla, en un proceso de hibridación. Existen tres tipos de sonda de ácidos
nucleicos:
- 1. Fragmentos de DNA ,
- 2. Fragmentos de RNA y
- 3. Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.
¿Qué son las moléculas reporter?
Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a
permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas
reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina,
Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa ...) y quimioluminiscentes
(ésteres de acridina).
¿Qué factores afectan a la sensibilidad y especificidad
de la reacción de hibridación?
- · Concentración del ácido nucleico diana
- · Complementariedad sonda-ácido nucleico diana
- · Concentración de la sonda.
- · Longitud de la sonda
- · Actividad específica de la molécula reporter.
- · Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, ...)
- · Tm
- · Acceso al ácido nucleico diana.
APUNTES DE LOS ARCHIVOS ENTREGADOS EN LA CLASE DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL
martes, 4 de diciembre de 2012
4.4. BIOETICA Y REVOLUCION BIOTECNOLOGICA
BIOETICA:
En un contexto bioético quizá podría ser conveniente
hacer una valoración general sobre lo que significa la introducción de genes
humanos en organismos no humanos. Habría que distinguir dos situaciones
diferentes: la primera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no
humano se hace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la
transferencia del gen humano al organismo no humano se hace exclusivamente en
beneficio (o perjuicio) de este último. Desde el punto de vista bioético, la
situación creada por la obtención de mamíferos transgénicos portadores de genes
humanos para la obtención de proteínas terapéuticas humanas no es esencialmente
nueva ya que, desde los primeros tiempos de la ingeniería genética molecular,
se han introducido genes humanos en células bacterianas para obtener proteínas
humanas (insulina, hormona de crecimiento, interferón, etc.). Tanto en el caso
de las bacterias como de los animales transgénicos que se convierten en factorías
naturales (biorreactores) de proteínas humanas, la valoración ética es
positiva. En este último caso es importante señalar además que, al quedar
restringida la expresión del gen humano a las células de la glándula mamaria,
la fisiología y desarrollo del animal no se ven alterados y por tanto se evita
cualquier daño a éste, quedando protegidos así los derechos de los animales.
En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del
transgén humano se realiza con el único propósito de influir en el desarrollo
del animal, la valoración ética puede ser negativa si se producen anomalías
importantes en su fisiología, como ocurrió en los cerdos que habían incorporado
el gen humano de la hormona del crecimiento. Finalmente, en este contexto
¿podría decirse que algún gen humano concreto - en definitiva, un trozo de ADN
- merecería un tratamiento o valoración ética diferente al resto? La respuesta
lógica sería negativa, so pena de caer en una sacralización del ADN humano.
¿Cuál es la valoración ética de los xenotrasplantes? En
primer lugar, habría que tener la garantía suficiente de que no hay problemas
de transmisión viral. Aún sentada esta premisa, hay que reconocer que a muchas
personas les repugna, en principio, la idea de que alguien pueda llevar un
órgano animal. Sin embargo habría que recordar que desde hace mucho tiempo se
realiza la implantación de válvulas de cerdo a personas con ciertas
insuficiencias cardiacas y todo el mundo ha aceptado esta práctica médica. Por
otro lado, la existencia de prótesis de material inerte (plástico, metales,
etc.) podría ser igualmente rechazado y no lo es. Ciertamente, desde el punto
de vista ético parece que no habría razón para rechazar los xenotrasplantes en
la medicina del futuro, siempre que se solucionen todos los aspectos técnicos -
que son muchos - que aún quedan por resolver.
INFORMACION
OBTENIDA DE LOS ARCHIVOS QUE PROPORCIONO EL PROFESOR DURANTE LA CLASE.
4.3. LEGISLACIÓN
Herramientas Legales
- n Agenda 21
- n Constitución,
- n Convenio de la Diversidad Biológica,
- n Protocolo de Cartagena,
- n Ley General de Salud,
- n Ley Federal de Sanidad Vegetal,
- n Ley sobre Producción, Certificación y Comercio de Semillas,
- n Ley General de Equilibrio Ecológico y Protección al Ambiente,
- n Ley de Desarrollo Rural Sustentable,
- n [ Ley de Bioseguridad]
- n Reglamentos
- n Normas: FITO 056, [FITO-ECOL 200?]
Acuerdos internacionales
y regulación en México sobre el uso de los OGMs
La utilización
y liberación al ambiente de los OGMs, ha despertado cuestionamientos y el
establecimiento de acuerdos internacionales y de legislaciones a nivel nacional,
como:
- i. Convenio sobre la Diversidad Biológica (CDB), en vigor a partir de 1993, entre otros se establece el compromiso del establecer un acuerdo sobre la seguridad de la biotecnología
- ii. Protocolo de Cartagena sobre la Seguridad de la Biotecnología del CDB, ratificado por México, entrando en vigor el 11 de septiembre de 2003. Establece el compromiso de definir regulaciones y medidas necesarias para evaluar los movimientos transfronterizos de los OGM’s.
Ley
de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGM)
En México, el Congreso de la Unión con el apoyo del Comité de Biotecnología de la Academia
Mexicana de Ciencias, en cumplimiento con compromisos internacionales
adquiridos, después de un proceso de
consulta, discusión y revisión que tuvo una duración de tres años, emitió
la Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGM). El
objetivo es garantizar la protección de
la salud humana, del medio ambiente, la diversidad biológica y de la sanidad
animal, vegetal y acuícola, de actividades con OGMs. Entre los elementos que
contiene se encuentran:
- n Definición de los principios y política de bioseguridad -como la evaluación caso por caso y paso por paso, con base en conocimiento científico;
- n Determinación de competencias de diferentes dependencias gubernamentales;
- n Establecimiento de las bases para el funcionamiento de la Comisión Intersecretarial de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (CIBIOGEM);
- n Establecimiento de regímenes para el manejo de OGMs (permisos, avisos y autorizaciones),
- n Bases para el establecimiento del Sistema Nacional de Información sobre Bioseguridad y el Registro Nacional de Bioseguridad de OGMs;
- n Determinación de áreas geográficas libres de OGMs.
- n Definición de las bases para establecimiento de Normas en materia de bioseguridad;
- n Establecimiento de las medidas de control y sanciones;
- n Definición de los mecanismos para la participación pública,
- n Acceso a la información y la participación social a través del Consejo Consultivo Mixto de la CIBIOGEM;
- n Definición de instrumentos de fomento a la investigación científica y tecnológica en materia de bioseguridad y biotecnología, entre los más importantes.
Usos ilegales y cuestionables de ciertos OGMs
La LBOGM
señala explícitamente, que ningún OGM podrá ser utilizado como arma biológica.
Es posible construir OGMs que pudieran tener impactos negativos en la salud
humana, animal y vegetal. Estos OGMs no pueden ni deben siquiera construirse. Ejemplos
de este tipo pudieran ser bacterias que normalmente viven en el intestino del
humano a las que se incorporaran genes productores de toxinas que afectan la
salud como la toxina del botulismo o del cólera. A nivel de las plantas, un
ejemplo podría ser la utilización de genes terminadores o virales que impidan
la germinación de las siguientes generaciones de semillas, ya que estos genes
pudieran transmitirse a otras plantas generando daño. Existe consenso en la
comunidad científica nacional sobre el hecho de que las plantas comestibles, y
de manera específica el maíz, no debe modificarse genéticamente para que
produzca sustancias de interés industrial, tales como plásticos, aunque fuesen
de naturaleza biodegradable. En principio, podrían utilizarse plantas como el
tabaco para la producción de ciertos medicamentos y de otros compuestos que hoy
se producen vía industria petrolera para reducir la contaminación, en virtud de
que el tabaco no es una planta comestible.
INFORMACION
OBTENIDA DE LOS ARCHIVOS QUE PROPORCIONO EL PROFESOR DURANTE LA CLASE.
4.2.5.2. ANIMALES TRANSGÉNICOS
Normalmente, en los organismos superiores animales o
vegetales la información genética se transmite por mecanismos de reproducción
sexual; es lo que se conoce como transmisión genética vertical. Sin embargo,
hace ya unos veinte años se logró obtener los primeros ratones transgénicos
mediante transferencia génica por inyección directa de ADN extraño en un cigoto
obtenido por fecundación in vitro; es decir, se trataba de una transmisión
genética horizontal, también llamada transgénesis. A partir de las experiencias
de Gordon, Ruddle y colaboradores iniciadas en 1980 en las que inyectaron ADN
de ratón en uno de los pronúcleos de un cigoto de la misma especie, se inició
una nueva era en la manipulación genética de embriones de mamíferos. Al año
siguiente, Gordon y Ruddle (1981) demostraban la integración y transmisión
estable a través de la línea germinal de genes inyectados en pronúcleos de
cigotos de ratón obtenidos por fecundación in vitro. Eran los primeros ratones
transgénicos. El paso siguiente consistió en probar que también se podían
obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgén) de
otra especie. Así, Palmiter y colaboradores (1982) obtuvieron ratones
transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto el gen de la
rata que codifica para la hormona del crecimiernto. Incluso, se obtuvieron
también ratones transgénicos gigantes cuando el transgén introducido era el gen
humano que codifica para la hormona de crecimiento (Palmiter et al., 1983).
3505.- El ratón transgénico, que lleva incorporado el gen de la
hormona de crecimiento de la rata, tiene un aumento de tamaño del 80% en comparación
con un ratón normal. Como era de esperar, a los ratones transgénicos siguieron
los conejos, ovejas y cerdos transgénicos a los que se les había introducido
por microinyección en uno de los pronúcleos del cigoto el ADN del gen humano
que codifica para la hormona de crecimiento, en un intento de aumentar el
tamaño de tales animales (Hammer et al., 1985). Sin embargo, este avance científico
no tuvo aplicación zootécnica porque la presencia del transgén modifica la
fisiología del animal transgénico, produciendo efectos colaterales
perjudiciales para su desarrollo. De cualquier manera, la era de la trangénesis
animal había comenzado como una realidad imparable.
4092.- Cerdo transgénico que lleva incorporado el gen humano
de la hormona del crecimiento. Su desarrollo presentaba trastornos fisiológicos
importantes (Fuente: M.R.Cummings, 1995, Herencia Humana, 3ª edición,
Interamericana)
MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS
Como se indicaba anteriormente, las investigaciones
llevadas a cabo a principio de los años ochenta no fueron más que el
lanzamiento de una serie ininterrumpida de avances, tanto en la investigación
básica como en la utilización práctica de los animales transgénicos. En el
cuadro adjunto se incluyen los principales hitos relacionados con la obtención
y desarrollo de los mamíferos transgénicos:
1938: Spemann
propone experimento de transferencia nuclear
1949: Hammond
mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro
1961: Tarkowski
obtiene ratones quiméricos agregando embriones
1966: Lin
describe la técnica de microinyección de embriones de ratón
1980: Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones
transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981:
n
Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por
microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón.
n
Evans y Kaufman obtienen células embrionarias
totipotentes de ratón
1982: Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes
mediante transgenes de la hormona del crecimiento de la rata
1983:
n
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes
mediante transgenes de la hormona de crecimiento humana.
n
McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para
experimentos de transferencia nuclear en ratón
1985: Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos
(conejos, ovejas, cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano
1987: Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout
por recombinación homóloga
1989: Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen
humano del factor IX de coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN
en el pronúcleo del cigoto
1991:
n
Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen
humano de la a -1-antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo
de cigotos.
n
Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH
humano (activador tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADN en
pronúcleo de cigoto.
n
Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen
humano de la lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de
cigotos.
1993:
n
Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo
de embriones.
n
Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con
cromosomas artificiales de levaduras
1994: Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por
transplante de espermatogonias
1996: Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por
transferencia nuclear de células embrionarias en cultivo
1997:
n
Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia
nuclear de células diferenciadas fetales y adultas en cultivo
n
Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por
transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1998: Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por
transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1999:
n
Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por
transferencia nuclear
n
Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante
la co-inyección de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
Las técnicas de obtención de animales transgénicos son:
n Microinyección
de ADN en núcleo de ovocito
n Microinyección
de ADN en pronúcleo o en citoplasma de cigoto (óvulo fecundado)
n Electroporación
de cigoto
n Transfección
de células totipotentes
n Co-inyección
en ovocitos de una mezcla de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
n Vectores
virales
n Transfección
de gametos
n Transferencia
de núcleos transfectados (clonación)
n 4149.- Técnica de obtención de ratones transgénicos mediante
microinyección de ADN en el pronúcleo masculino de un cigoto obtenido por
fecundación in vitro (Fuente: H. Lodish et al., 1995, Molecular and Cell
Biology, Scientific American Books)
PROBLEMAS DE LA TRANSGÉNESIS
La introducción de una nueva información genética (el
transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentar algunos problemas
en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal como se indica a
continuación:
n Integración
múltiple (en tándem o no)
n Lugar de
integración indeterminado (efecto de posición)
n Metilación
y falta de expresión
n Mosaicismo
(germinal y somático)
n Expresión
específica/ectópica
n Expresión
variable
n Expresión
variable dentro de líneas (variegación)
En cualquier caso, el ideal sería poder dirigir con total
precisión el lugar de integración del transgén. Así, por ejemplo, en 1999 se
obtuvieron en el Roslin Institute de Edinburgo las ovejas transgénicas
"Cupid" y "Diana" a partir de la clonación de cultivos
celulares modificados mediante recombinación homóloga ("gene
targeting").
OBJETIVOS: APLICACIONES
La Biotecnología incluye "cualquier técnica que
utilice organismos vivos o parte de los organismos para fabricar o modificar
productos, mejorar plantas o animales o desarrollar microorganismos para usos
específicos" (Rodríguez-Villanueva, 1986). La potencialidad de la
biotecnología estriba en producir cantidades ilimitadas de:
n Substancias
de las que nunca se había dispuesto con anterioridad
n Productos
que se obtenían en pequeñas cantidades
n Abaratamiento
de los costes de producción
n Mayor
seguridad en los productos obtenidos
n Nuevas
materias primas, más abundantes y menos caras
Dentro de este contexto general, la Biotecnología ha
incorporado la transgénesis animal con los fines que se indican a continuación:
n Mejora de
caracteres productivos
n Resistencia
a enfermedades
n Modelos
animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout)
n Animales
transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de alto valor
(proteínas terapéuticas): Las "granjas farmacéuticas" o "granjas
moleculares"
n Donación
de órganos: Xenotransplantes
LAS GRANJAS FARMACÉUTICAS
La Biotecnología ha aplicado estas técnicas
experimentales de transgénesis y ya hoy se están estableciendo las primeras
granjas farmacéuticas en las que se crían ovejas, cabras, vacas o cerdos
transgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas (ver
Velander et al., 1997). La manipulación genética de un mamífero doméstico
transgénico consiste, en primer lugar, en preparar el fragmento de ADN que
contiene el gen humano, uniéndolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un
elemento regulador (promotor) procedente de un gen que promueve la síntesis de
una proteína de la leche (por ejemplo, la b -lactoglobulina, la caseína, etc.).
De esta manera se asegura que el gen humano sólo se expresará en las células de
las glándulas mamarias del animal transgénico (oveja, cabra, vaca, cerdo)
obtenido tras la inyección del ADN manipulado en el pronúcleo masculino de un
cigoto producido por fecundación in vitro. Sin embargo, actualmente, la
utilización de la técnica de clonación por transferencia de núcleos de células
genéticamente modificadas resulta más ventajosa. Con esta última técnica, los
investigadores del Roslin Institute de Edinburgo obtuvieron por vez primera en
1997 ovejas transgénicas procedentes de núcleos de fibroblastos fetales a los
que se les había introducido el gen humano que codifica para el factor IX de
coagulación de la sangre (Schnieke et al., 1997). Los resultados de estos
autores demostraron además que la utilización de la técnica de clonación de los
núcleos modificados genéticamente es mucho más eficaz que la técnica original
de microinyección de ADN en los pronúcleos de los cigotos. Posteriormente, con
estas técnicas se ha conseguido que la leche de las hembras transgénicas
contenga también otras proteínas terapéuticas humanas (a -1-antitripsina,
proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina III, etc.) que pueden
luego ser fácilmente separadas de las restantes proteínas propias del animal.
Además es importante señalar que el animal transgénico no se ve perjudicado en
su desarrollo porque el gen humano sólo se expresa en las células de las
glándulas mamarias debido al regulador específico al que se le ha asociado y,
por tanto, en las restantes células del animal no se sintetiza la proteína
humana al estar silenciado el gen humano. En consecuencia, el animal doméstico
ha sido convertido en un gran biorreactor sin perjuicio aparente para él. Las
primeras granjas farmacéuticas fueron establecidas por compañías
biotecnológicas como Pharmaceutical Proteins Ltd (PPL) en Escocia (1500
ovejas), Genzyme Transgenics en Estados Unidos (1000 cabras), Gene Pharming
Europe en Holanda (vacas), etc. Otros grupos de investigación son partidarios
de la utilización de las granjas de cerdos transgénicos dado su corto tiempo de
gestación (cuatro meses), el intervalo generacional (un año) y el mayor tamaño
de las camadas (10 a 12 lechones), teniendo en cuenta además que una cerda
lactante produce unos 300 litros de leche al año. Las cifras económicas
demuestran la importancia futura de las granjas farmacéuticas : el mercado de
proteínas terapéuticas, que actualmente se obtienen principalmente mediante
fermentación o cultivo celulares, se estima en unos 7.600 millones de dólares
anuales y se calcula que podrá llegar a ser de 18.500 millones de dólares el
año 2000. Las cifras expresadas parecerían justificar las enormes inversiones
que es necesario hacer para obtener animales transgénicos, tal como se indica
en el cuadro adjunto:
Ovejas transgénicas: Los pacientes de
enfisema hereditario necesitan ingerir grandes dosis de a -1-antitripsina para
suplir su deficiencia en plasma, donde la concentración es de 2 mg/ml. Pues
bien, en el Roslin Institute de Edinburgo, en colaboración con la empresa PPL,
se han obtenido por diversos procedimientos ovejas transgénicas portadoras del
gen humano que codifica para la a -1-antitripsina (unido al promotor de la b
-lactoglobulina para que se exprese exclusivamente en las células de la
glándula mamaria. Así, el grupo que dirige el Dr. Ian Wilmut microinyectaron
549 cigotos con el ADN del gen humano unido al promotor del gen de la b
-lactoglobulina de oveja, obteniendo 113 individuos de los que cinco (un
cordero y cuatro ovejas) eran transgénicos. Las ovejas producían más de 1 mg/ml
de a -1-antitripsina en la leche e, incluso, una de ellas, que presentaba un mayor
número de copias del transgén integradas en el genoma, llegó a producir hasta
63 mg/ml durante la primera semana, pero luego se estabilizó en 35 mg/ml
(Wright et al., 1991). El mismo grupo de investigación ha obtenido también
ovejas transgénicas portadoras del gen humano que codifica para el factor IX de
coagulación de la sangre (antihemofílico), primero mediante la técnica de
microinyección en el pronúcleo del cigoto del correspondiente gen humano (ADNc)
unido al promotor del gen de la b -lactoglobulina de la oveja (Clark et al.,
1989) y más tarde mediante la técnica de clonación: transferencia de núcleos de
fibroblastos fetales genéticamente modificados (Schnieke et al., 1997).
Cabras transgénicas: Las cabras
también pueden constituir unos buenos biorreactores de proteínas humanas puesto
que producen 4 litros/día de leche y sus períodos de gestación y de desarrollo
son cortos (5 y 8 meses, respectivamente). Así, Ebert et al. (1991) obtuvieron
cabras transgénicas portadoras del gen humano que codifica para el activador
tisular de plasminógeno (AtPH) que, al estar unido al promotor del gen de la b
-caseína de la cabra, producía hasta 2-3 mg/ml de AtPH en la leche del animal.
La proteína podía ser aislada con una pureza del 98% y una actividad específica
de 610.000 U/mg (Denman et al., 1991).
Vacas transgénicas: La gran
producción lechera de las vacas (10.000 litros/año, 35 g proteína/litro de
leche) las convierte en poderosos biorreactores de proteínas humanas. En 1991,
tres grupos de investigación de Holanda (la Universidad de Leiden, la empresa
Gene Pharming Europe y el Instituto de Producción Animal de Zeist) obtuvieron
vacas transgénicas portadoras del gen humano de la lactoferrina que se
sintetizaba en la leche del animal por estar unido al promotor de la a
-S1-caseína bovina. Así, Krimpenfort et al. (1991) inyectaron 1.154 pronúcleos
de otros tantos cigotos obtenidos por fecundación in vitro, de los cuales
sobrevivieron 981. A los 9 días transfirieron 129 embriones a vacas estimuladas
hormonalmente (pseudopreñez), quedando 21 de ellas preñadas y sólo 16 llevaron
a término la gestación. Se obtuvo un macho y una hembra (que era un mosaico).
El macho dio positivo para la presencia del gen humano en todos los tejidos
analizados (placenta, oreja y sangre), estimándose que era portador de 5 a 10
copias del gen humano. Más tarde, otro grupo de investigación (Cibelli et al.,
1998) obtuvo tres terneros clónicos transgénicos que llevaban el trasgén
híbrido b -gal-neo que se expresaba con un promotor muy potente del
citomegalovirus. En el caso de las vacas, otros objetivos pueden ser la
aplicación de la técnica conocida como "modelo de la glándula
mamaria" para reducir la lactosa (para los casos de intolerancia) o
fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la técnica
de "knockout" del gen de la b -lactoglobulina de la leche de vaca
para imitar a la leche humana que no la tiene.
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