2.1.1.4. ÁREA DE INCUBACION

Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o en cámaras de crecimiento; debe proporcionar un buen control de la temperatura (20-28 °C), la iluminación variable, según las necesidades: 1000 a 5000 lux y de humedad relativa (70%-80%). En el cuarto de incubación se instalan estanterías metálicas o de madera para colocar los cultivos. En el área debe incluirse también espacio para cultivos en agitación y para cultivos estáticos en oscuridad.  Es necesario propiciar una buena distribución del aire en este cuarto para evitar zonas de recalentamiento por efecto de las luces o lámparas. Cuando se utilizan tubos fluorescentes, es conveniente sacar los transformadores fuera de este cuarto.

La regulación de la temperatura se puede lograr por medio de aparatos de aire acondicionado de pared o de un sistema central. En cualquier caso es necesario tomar precauciones para evitar el calentamiento excesivo, instalando alarmas y controles para cortar la iluminación cuando falle el aire acondicionado.

2.1.1.3. ÁREA DE SIEMBRA ASEPTICA

Área limpia, diseñada y construida para minimizar la contaminación por partículas viables y no viables y mantenerla dentro de límites preestablecidos. Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo. Un ambiente propicio para el desarrollo de microorganismos es el conjunto medio de cultivo – explante, pudiendo destruir tales cultivos; por lo cual es necesario evitar los contaminantes. Es difícil lograr cultivos completamente estériles, ya que pueden existir virus en el interior del explante, pero se puede controlar a los demás organismos tomando en cuenta las siguientes normas:

a)    Trabajar en ambientes adecuados.

b)    Esterilizar los medios de cultivo.

c)     Desinfectar superficialmente los explantes, liberándolos de bacterias y hongos exógenos.

http://www.buenastareas.com/ensayos/Laboratorio-Cultivo-In-Vitro-Vegetales/2865929.html

La "Técnica aséptica" tiene como objetivo:

a)    evitar que el operador se contamine con microorganismos procedentes de las muestras o cultivos y

b)  evitar la contaminación de las muestras y cultivos con microorganismos procedentes del ambiente o del propio operador.

En esta área se realizan el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explante a los medios de cultivo. Este trabajo demanda los más altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado o bajo presión o la construcción de cuartos de transferencia. Sin embargo, ciertas operaciones de inoculación como la excisión y el cultivo de ápices y meristemas en tubos de ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en un lugar del laboratorio libre de corrientes de aire y de polvo.  Los gabinetes de flujo laminar deben ubicarse en lo posible en un lugar alejado de las puertas y con un mínimo de corriente de aire, con el fin de prolongar la vida útil de los filtros.

2.1.1.2. ÁREA DE ALMACENAMIENTO

Las células procedentes de cultivos primarios o de líneas celulares establecidas pueden almacenarse durante largos períodos de tiempo en temperaturas bajo cero. Para ello se utilizan sistemas criogénicos como veremos en el apartado siguiente. Con la criopreservación se favorece:

 

n  El mantenimiento de células sin tener que utilizar tejidos animales primarios

n  Evitar la pérdida de la línea por contaminación

n  Evitar la pérdida de la línea por cambios genéticos

http://histolii.ugr.es/jmgarcia/cultivos/cultivos.pdf

2.1.1.1. ÁREA DE PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACION.

ÁREA DE PREPARACION: Se utiliza principalmente para la preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también un espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico y los reactivos químicos. Este ambienta debe de contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación, y otros elementos; también debe incluir vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o la cámara de crecimiento (o para ambas).

 AREA DE ESTERILIZACION: Puede estar constituida por dos áreas conectadas entre sí, o por un solo ambiente, y puede estar localizada dentro del área general de preparación. Esta área debe tener espacio para el autoclave vertical u horizontal, el cual puede ser pequeño (olla de presión) o grande (de carga frontal y de enfriamiento lento y rápido), según sea el volumen del material que se pocese, también puede incluir espacio para estufas, secadores y un lavadero con agua caliente y fría.

 

La esterilización es eliminar todos los microorganismos presentes en nuestro material. Todos los aparatos, superficies y materiales utilizados para cultivar deben ser esterilizados. Para su esterilización se pueden emplear métodos y/o agentes:

 

Métodos físicos:

n  Calor húmedo: autoclave

 

 

n  Calor seco: estufas y flameado a la llama.

 

 

n  Rayos ultravioleta.

n  Filtración.

 

 

Métodos químicos:

n  Hipoclorito de sodio, cloro comercial al 10%

n  Alcohol etílico al 70%

n  Cloruro de benzalconio

 

http://www.slideshare.net/guest5e31b0e1/medios-de-cultivo

 

AREA DE LAVADO: Debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría y una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada; para tal efecto se debe usar un destilador de vidrio o de material no toxico y un desionizador de agua colocado entre el destilador y el lavadero. Esta área debe disponer de un espacio para almacenar agua destilada en botellas de plástico; también debe proveer basureros adecuados para el material vegetal, inorgánico y de vidrio que se deseche.

2.1.1. ÁREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

Un laboratorio de cultivo de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en el; en la práctica, sin embargo, algunas funciones pueden desarrollarse en un mismo ambiente. El laboratorio de cultivo de tejidos debe disponer de un área destinada al establecimiento, crecimiento y multiplicación de la planta producida; esta área es especialmente necesaria en los laboratorios de investigación y desarrollo y en los de producción comercial. Finalmente, la decisión de establecer un laboratorio de cultivo de tejidos requiere de un estudio y análisis crítico acerca de la necesidad de hacerlo, dentro de un contexto integral del desarrollo de la investigación y la producción agrícola o forestal de una región o país. Por lo tanto, el establecimiento y funcionamiento del laboratorio debe ser idealmente el producto de esfuerzos multidisciplinarios.

 

 

2.1. MEDIOS DE CULTIVO

Para poder estudiar a un microorganismo es necesario cultivarlo. Cultivar a un microorganismo es proporcionarle las condiciones adecuadas para su crecimiento y multiplicación. El objetivo principal de cultivar a un microorganismo es obtener un cultivo anéxico, es decir un cultivo puro que se forma a partir de una sola célula. Es necesario brindarle las condiciones ambientales adecuadas de luz, temperatura, oxigenación, humedad, etc.  Un medio de cultivo es una solución liquida o gelatinosa que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos.

http://www.slideshare.net/guest5e31b0e1/medios-de-cultivo

 

 

Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras.

http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%204%20%20Medios%20de%20cultivo.pdf

 

 

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

 

Por su consistencia:

n  LIQUIDOS: También llamados caldos de cultivo, no contienen agar y se preparan en matraces pequeños.

n  SEMISOLIDOS: Contienen 0.5% de agar y se preparan en matraces pequeños.

n  SOLIDOS: Contienen de 1.5% a 2% de agar y se preparan en cajas de petri (placa) o en tubos de ensaye.

 

 

 

Por su composición:

n  DEFINIDO: Se conoce su composición exacta, se utiliza cuando ya se conocen los microorganismos que se van a cultivar.

n  COMPLEJO: No se conoce su composición, pueden tener sangre, leche, extracto de levadura o carne; se utiliza cuando no se conocen a los microorganismos o no se conocen sus requerimientos nutricionales.

n  MINIMO: Es un medio definido que proporciona solo los nutrientes necesarios.

 

Por su función:

n  SELECTIVOS: Promueve o inhibe el crecimiento de los micvroorganismos

n  DIFERENCIALES: Permiten distinguir entre diferentes tipos de microorganismos.

n  DE ENREQUECIMIENTO: Contiene factores de crecimiento, un nutriente esencial que el microorganismo no puede sintetizar.

 

 

 

http://www.slideshare.net/guest5e31b0e1/medios-de-cultivo

UNIDAD II: CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales. La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril. A su escala mayor, como ocurre en la industria de la micropropagación, el cultivo de tejido se ha convertido en un proceso de manufactura que puede producir material vegetal libre o saneado de patógenos, de alta calidad, que puede atravesar fronteras internacionales.

http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf

1.1.3. IMPORTANCIA: ECONOMICA, ECOLOGICA Y AGRONOMICA DE LA BIOTECNOLOGIA

La biotecnología cuenta con diversas tendencias de aplicación. En lo que respecta al sector agropecuario, se caracteriza por obtener plantas transgénicas, resistentes a plagas como las bacterias, los hongos, los virus, los insectos, etc.Estas plantas son de vital importancia para los agricultores, ahorrándoles gran cantidad de dinero y tiempo, así como la posibilidad de brindar un producto de mejor calidad. Las tendencias en el sector pecuario se enfocan en aumentar la productividad y la calidad de la carne y la leche, mediante el uso de hormonas, vitaminas y enzimas. En lo referente a la salud, la tendencia se orienta hacia la producción de proteínas y su uso a nivel terapéutico. Asimismo, se suele aplicar en la creación de nuevos métodos de administración de medicamentos y en la biología molecular del genoma humano. En las tendencias relacionadas al tratamiento de la contaminación ambiental, la biotecnología se basa en el aprovechamiento de los recursos, manteniendo un equilibrio armonioso entre el hombre y su entorno.

http://guiafitness.com/tendencias-de-la-biotecnologia.html

La biotecnología ofrece nuevas y diversas oportunidades de negocio a las empresas. Por ejemplo, la biotecnología ambiental además de generar empresas exitosas en el tratamiento de aguas, ha permitido optimizar el procesamiento del petróleo y ha disminuido los efectos contaminantes del mismo. En el ecosistema se trabaja con microorganismos que son capaces de degradar una amplia gama de compuestos contaminantes como grasas, detergentes, plásticos o plaguicidas. En el caso del sector minero, la biotecnología ayuda mediante la utilización de bacterias a obtener metales como el cobre y el oro. Sin embargo, la rama de biotecnología que ha registrado la mayor actividad y ha polarizado la discusión sobre el tema ha sido la agrícola. El sector agrícola representa el 5% del PIB mexicano y más del 20% de la población depende directamente de esta actividad, especialmente las clases más desprotegidas: los campesinos y los indígenas, que se consideran amenazados por la Ley de Bioseguridad, a la que acusan de favorecer a las grandes multinacionales.

http://www.wharton.universia.net/index.cfm?fa=viewArticle&ID=992

 

 

Algunas aplicaciones de la Biotecnología

-        Bancos de secuencias de DNA y Proteínas

-        Secuenciación de genomas completos

-        Aplicaciones forenses

-        Aplicaciones diagnósticas

-        Terapia génica

-        Nuevos tipos de alimentos

-        Control medioambiental

-        Resistencia a plagas y enfermedades

-        Aclimatación vegetal

-        Reproducción monocelular en vegetales

-        Procesos industriales enzimáticos:

* Industrias del almidón

* Detergentes

* Industrias lácteas

* Industrias de la fruta

* Antibióticos

-        Biosensores y biochips

 Cuestiones socioculturales y éticas planteadas por la Biotecnología

-        Los medios de comunicación

-        Polémica sobre organismos transgénicos

-        El Ciudadano y el Científico

-        La epidemia de SIDA

-        La preocupación medioambiental

-        Los fundamentalismos en auge

-        Nuevos problemas no previstos

1.1.2. BIOTECNOLOGIA DE PRIMERA, SEGUNDA Y TERCERA GENERACION

A principios del siglo pasado, la biotecnología empieza a adquirir bases cada vez más científicas. La interacción de la biología, la medicina y las ciencias físicas, generan nuevas disciplinas como a genética, biología molecular, acelerando el conocimiento.

1a. Generación: procesos industriales, que aunque sean a gran escala utilizan tecnologías elementales o avanzadas y microorganismos naturales

2a. Generación: comprende la genética microbiana, bioquímica, enzimología, inmunoquímica y las técnicas de cultivos celulares in vitro, contiene alta tecnología y produce entre otros antibióticos, fármacos, proteína, a.a. etc..

3a. Generación: surge a finales de los 70, comprende técnicas derivadas de la “ingeniería biológica”, es el DNA recombinante y fusión celular

4ª Generacion: Desde finales del siglo XX hasta la actualidad, el desarrollo científico sigue evolucionando enormemente. Surge así ciencias como la Genómica, la Proteómica y la Bioinformática. La Genómica engloba la secuenciación del genoma de un organismo en particular, su interacción y su funcionamiento. Así se ha llevado a cabo el Proyecto Genoma Humano, donde además de describir los genes del hombre y otras especies, se ha estudiado la relación que hay entre ellos. La Proteómica se encarga del estudio del conjunto de proteínas expresadas por un organismo, es decir, las proteínas codificadas por un genoma en particular en una situación determinada y en un momento dado.  Debido al elevado número de datos que se obtienen en estas ciencias, se requiere de la Bioinformática, para que sean procesados con la mayor rapidez posible. De esta manera tenemos que la Biotecnología de Cuarta Generación se diferencia, sobre todo, de la anterior en la gran cantidad de datos que se obtienen, la rapidez con la que éstos se procesan y que requiere de herramientas novedosas que tienen un alto coste económico. http://mbbua.wetpaint.com/page/Biotecnolog%C3%ADas+de+Tercera+y+Cuarta+Generaci%C3%B3n

1.1.1. RESEÑA HISTORICA DE LA BIOTECNOLOGIA

• 6000 AC: Arte de fermentar. Los sumerios y babilonios usaban levaduras para fabricar cerveza.
• 4000 AC: Los egipcios descubrieron la manera de fermentar pan con la levadura cervecera.
• 1.000 a. C.: Los babilonios celebraban con ritos religiosos la polinización de las palmeras.
• 323 a. C. :Aristóteles especula sobre la naturaleza de la reproducción y la herencia.
• 1676: Se confirma la reproducción sexual de las plantas.
• 1838: Se descubre que todos los organismos vivos están compuestos por células.
• 1859: Darwin hace pública su teoría sobre la evolución de las especies.
• 1866. Mendel descubre en los guisantes las unidades fundamentales de la herencia.
• 1871: Se aísla el ADN en el núcleo de una célula.
• 1887: Se descubre que las células reproductivas constituyen un linaje continuo, diferente de las otras células del cuerpo.
• 1909: Las unidades fundamentales de la herencia biológica reciben el nombre de genes.
• 1910: Un biólogo americano, Thomas Morgan presenta sus experimentos con la mosca de la fruta, que revelan que algunos fragmentos genéticos son determinados por el sexo.
• 1919: Karl Ereky, ingeniero húngaro, utiliza por primera vez la palabra biotecnología.
• 1925: Se descubre que la actividad del gen está relacionada con su posición en el cromosoma.
• 1927: Se descubre que los rayos X causan mutaciones genéticas.
• 1943: El ADN es identificado como la molécula genética.
• 1940 a 1950: Se descubre que cada gen codifica una única proteína.
• 1953: El bioquímico americano James Watson y el biofísico Francis Crick anuncian la estructura en doble hélice del ADN o código genético.
• 1956: Se identifican 23 pares de cromosomas en las células del cuerpo humano.
• 1961: Desciframiento de las primeras letras del código genético.
• 1965: El biólogo norteamericano R. W. Holley «leyó» por primera vez la información total de un gen de la levadura compuesta por 77 bases, lo que le valió el Premio Nobel.
• 1966: Se descifra el código genético completo del ADN.
• 1970: el científico estadounidense Har Gobind Khorana consiguió reconstruir en el laboratorio todo un gen.
• 1972: Se crea la primera molécula de ADN recombinante en el laboratorio: genes de una especie son introducidos de otras especies y funcionan correctamente.
• 1973: Se desarrolla la tecnología de recombinación del ADN por Stanley Cohen, de la Universidad de Stanford, y Herbert W. Boyer, de la Universidad de California, San Francisco.
• 1975: La Conferencia de Asilomar evalúa los riesgos biológicos de las tecnologías de ADN recombinante, y agrupa una moratoria de los experimentos con estas tecnologías. Se fundó Genentech Incorporated, primera empresa de ingeniería genética.
• 1976: Robert Swanson y Dr. Herbert Boyer crean Genentech, la primera compañía de biotecnología.
• 1977: Se fabricó con éxito una hormona humana en una bacteria.
• 1978: Se clonó el gen de la insulina humana.
• 1980: El Tribunal Supremo de los Estados Unidos de América dictamina que se pueden patentar los microbios obtenidos mediante ingeniería genética.
• 1981: Primer diagnóstico prenatal de una enfermedad humana por medio del análisis del ADN.
• 1982: Se crea el primer ratón transgénico., llamado "superratón", insertando el gen de la hormona del crecimiento de la rata en óvulos de ratona fecundados.Se produce insulina utilizando técnicas de ADN recombinante.
• 1983: Se inventa la técnica PCR (reacción en cadena de la polimerasa), que permite copiar genes específicos con gran rapidez. Es una técnica muy poderosa para producir millones de copias de una región específica de ADN, que permite analizarla tan rápido como se puede purificar una sustancia química. PCR ha sido el instrumento esencial en el desarrollo de técnicas de diagnóstico, medicina forense y la detección de genes asociados con errores innatos del metabolismo. Se aprueban los alimentos trasgénicos producidos por Calgene. Es la primera vez que se autorizan alimentos transgénicos en Estados Unidos.
• 1984: Creación de las primeras plantas transgénicas.
• 1985: Se utiliza por primera vez la "huella genética" en una investigación judicial en Gran Bretaña.
• 1986: Se autorizan las pruebas clínicas de la vacuna contra la hepatitis B obtenida mediante ingeniería genética.
• 1987: Propuesta comercial para establecer la secuencia completa del genoma humano, Proyecto Genoma Humano.
  Comercialización del primer anticuerpo monoclonal de uso terapéutico.
   
• 1988: La Universidad de Harvard patenta por primera vez un organismo producido mediante ingeniería genética, un ratón.
  Se crea la organización HUGO para llevar a cabo el Proyecto Genoma Humano: identificar todos los genes del cuerpo humano.
   
• 1989: Comercialización de las primeras máquinas automáticas de secuenciación del ADN.
• 1990: Primer tratamiento con éxito mediante terapia génica en niños con trastornos inmunológicos (niños burbuja). Se ponen en marcha numerosos protocolos experimentales de terapia génica para intentar curar enfermedades cancerosas y metabólicas.
• 1994: Se comercializa en California el primer vegetal modificado genéticamente, un tomate, y se autoriza en Holanda la reproducción del primer toro transgénico.
• 1995: Se completan las primeras secuencias de genomas de bacterias.
• 1996: Por primera vez se completa la secuencia del genoma de un organismo eucariótico, la levadura de cerveza.
• 1997: Investigadores, liderados por Ian Wilmut clonan al primer mamífero, la oveja Dolly.
• 2001: Se publica el mapa provisional del genoma humano.
• 2004: La ONU y el Gobierno de Chile organizan el Primer Foro Global de Biotecnología, en la Ciudad de Concepción, Chile (2 al 5 de marzo)
• 2010: Craig Venter y su equipo de trabajo crea un cromosoma artificial en una célula competente.
• 2011: celula artificial

http://www.portaley.com/biotecnologia/bio8.shtml